脂质体介导双基因转染兔骨髓基质干细胞的体外成骨能力研究

发布时间：2018-04-11 10:13

本文选题：兔骨髓基质干细胞 + 双基因转染　；参考：《西南医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:(1)探索采用密度梯度离心法分离、贴壁法收集并体外培养兔骨髓基质干细胞并将其作为组织工程骨种子细胞的方法(2)探索利用脂质体介导BMP-2、VEGF-165双基因质粒转染兔骨髓基质干细胞的方法,明确经BMP-2、VEGF-165共转染后兔骨髓基质干细胞的细胞增殖能力变化(3)明确BMP-2、VEGF-165基因在共同转染兔骨髓基质干细胞后表达过程中的相互影响及双基因转染兔骨髓基质干细胞的体外成骨能力鉴定。方法:(1)提取健康新西兰兔的股骨骨髓,利用密度梯度离心分离骨髓成分、体外培养及增殖兔骨髓基质干细胞并鉴定。(2)利用Lipofect-amine2000脂质体介导A组:p IRES-h BMP2-h VEGF165转染组、B组:p IRES-h BMP2转染组、C组:p IRES-h VEGF165转染组、D组:空载体转染组的质粒分别转染兔骨髓基质干细胞。荧光显微镜观察前述各组以不同质粒转染兔骨髓基质干细胞后的形态并以MTT法绘制生长曲线,根据MTT结果和转染后荧光照片明确不同质粒转染后细胞的增殖能力变化。(3)通过酶联免疫吸附法等方法明确各组在不同质粒转染后BMP-2和VEGF-165基因的表达情况,以及根据对碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型骨胶原蛋白以及骨钙素染色水平的检测以比较其体外成骨能力与单基因转染组的区别。结果:(1)兔骨髓基质干细胞的形态变化:原代兔BMSCs分离的初始可见悬浮培养液中绝大多数的细胞为单个存在的较大体积圆形有核细胞,48小时后逐渐贴壁细胞变多,且部分细胞变为三角形、逗号形或短棍形,可观察到少许伪足形成;培养后6-10天时,许多贴壁细胞的体积逐渐变大,开始汇集形成集落并不断增大,细胞形态开始向多角形以及细长形变化,胞内变为1至2个细胞核;培养14天时培养瓶出现融合的单层细胞,大部分细胞的细胞核消失。传代后的兔BMSCs细胞呈球形或椭圆样,很快贴壁并重新变为梭子形,待细胞完全贴壁及密度提高后,细胞形状成为单一的梭形。经过传代后细胞的增殖速度较传代前变快,传代5到7天后细胞再次铺满培养瓶底,呈螺旋状均匀分布。进一步行连续传代后未见明显的细胞形态变化。基因转染后的兔骨髓基质干细胞仍为梭子形或多边形,分裂增殖速度较转染前有所降低。通过荧光显微镜观察,转染后24小时后各转染组即可见少量绿色荧光,证明转染成功,但转染率尚低。转染48-72小时后荧光逐渐增强,直至转染4d后见荧光强烈发出。(2)转染后MTT结果:各组细胞的OD值随培养时间增加而逐渐增长,各细胞组之间和每个细胞组在各时间点间所测得的OD值增长情况无明显统计学差异。P3代普通兔BMSCs细胞在1、2d时OD无明显变化,3d后OD值出现了明显增加直到第7d时达最大值。A组转染后的细胞在第1d和2d时OD值未见明显增长,第2天后OD值逐渐增长,增长幅度不及原代细胞大,OD值在第6d达高峰后缓慢下降进入平台期。B组及C组细胞OD值与生长曲线与A组细胞相当,两两对比未见明显统计学意义。而D组细胞与P3代普通兔BMSCs细胞OD值变化相比未见明显统计学意义。(3)不同质粒转染4d后,酶联免疫吸附法(Elisa)检测见p IRES-h BMP2-h VEGF165转染组BMP-2及VEGF-165基因表达达到最大化,分别与p IRES-h BMP2转染组及p IRES-h VEGF165转染组相比较,BMP-2和VEGF-165表达较单基因转染组明显升高,具有明确的统计学差异(P0.05),空质粒转染组为阴性表达。(4)在不同组质粒转染转染4d后,经形态学观察和免疫组化实验明确p IRES-h BMP2-h VEGF165转染组的Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素表达较p IRES-h BMP2转染组及p IRES-h VEGF165转染组、空质粒转染组明显提高,有统计学意义(P0.05)。结论:(1)利用脂质体介导BMP-2、VEGF-165双基因质粒体外转染对的兔骨髓基质干细胞的增殖能力无明显影响,与分别以BMP-2、VEGF-165单基因转染相比无明显区别;(2)双基因转染后VEGF-165和BMP-2基因在兔骨髓基质干细胞中得到了良好表达,相较VEGF-165、BMP-2基因分别单独转染兔表达水平显著提高,VEGF-165和BMP-2基因在共转染兔BMSCs细胞后的表达相互促进,具有协同成骨作用;(3)BMP-2、VEGF-165双基因转染后的兔骨髓基质干细胞相较单基因分别转染骨髓基质干细胞具有更优良的体外成骨能力,为接下来的实验过程中构建组织工程骨用于动物体内长段骨缺损修复提供了研究基础。
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【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R68

【参考文献】