miR-27a通过靶向调控PPARγ对酒精诱导大鼠BMSC分化的影响

发布时间：2018-04-12 14:00

本文选题：microRNA-27a + BMSC　；参考：《郑州大学》2015年硕士论文

【摘要】：研究背景:股骨头坏死是一种临床上非常常见的关节疾病,该病病因复杂,致残率高,一旦发病往往需要手术治疗,迄今罕有有效的预防方法,对患者的生活质量和生命健康都是一种严重威胁。目前非创伤性股骨头缺血性坏死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)日益多见,大量研究证明,慢性股骨头坏死多与激素和酒精的摄入有关。统计数据显示,在中国,慢性酒精中毒已经是诱发ONFH的主要原因之一。有研究表明,通过对大鼠、小鼠、家兔和鸡等长期使用大剂量酒精灌胃处理后,动物会在一定时间后出现明显的股骨头坏死现象。骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是一种多能干细胞,主要分化为成骨细胞,并能够分化为脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞等。体外培养的BMSCs经过酒精诱导后,会大量分化成脂肪样细胞,丧失成骨能力。过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)基因是一种关键的成脂转录因子,其在脂肪细胞中表达量非常高,且PPARγ的激活与干细胞的分化命运密切相关。大量研究表明,BMSC中PPARγ的激活会导致细胞成骨分化受阻,细胞转而向成脂方向分化,该过程在股骨头坏死过程中表现为骨质丧失和骨骼或关节修复受阻。Micro RNA是一种长度约20~24个核苷酸的短链非编码RNA,不同类型的micro RNA根据其特异的核苷酸序列可以靶向作用于不同基因的m RNA,在m RNA转录后水平调控基因的表达状况。micro RNAs的正常表达对维持正常生命活动至关重要,至今已经发现约60%的人类基因受micro RNAs的调控。一个micro RNA可以靶向调节多个基因,并且一个基因也可以被多个micro RNAs所调控。我们通过生物信息学数据库发现micro RNA-27a能够与PPARγ基因靶向配对,抑制BMSC中PPARγ的表达,阻碍BMSC的成脂分化,进而使BMSC正常的成骨分化能力得以恢复,从而达到对酒精性ONFH发生的抑制作用。研究目的:本实验通过体外合成micro RNA-27a mimics导入大鼠BMSCs细胞,观察micro RNA-27a对PPARγ基因的靶向调控作用,及对酒精诱导的BMSC成脂和成骨分化的影响,以此探讨micro RNA在ONFH的发生及防治中的作用。方法:1.实验分组:将大鼠BMSCs以1×106/cm2细胞密度,接种于6孔培养板,当细胞融合至80%时应用micro RNA mimics进行电击穿孔法转染,同时随机分组:①空白对照组:正常培养细胞,不做特殊处理。②酒精模型组:培养液中给予0.09 mol/L的酒精。③micro RNA-27a组:micro RNA-27a mimics转染细胞,并给予浓度为0.09mol/L的酒精同时处理。④Negative control组:无关序列合成mimics转染细胞,并给予浓度为0.09mol/L的酒精同时处理。2.荧光素酶报告基因实验检测micro RNA-27a与PPARγ3’UTR的结合情况。3.实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,Q-PCR)检测各组BMSCs中PAPRγ和Runx2基因表达的水平。4.酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、I型胶原(type I collagen)和骨钙素(osteocalcin,OCN)含量的差异。5.免疫印迹法(Western blot)检测各组BMSCs中Runx2和PPARγ的蛋白表达水平。6.脂肪染色及脂肪细胞计数检测BMSCs酒精诱导后脂肪生成的状态和成脂分化的程度。7.酶偶联比色法检测BMSCs中甘油三酯(TG)的含量。结果:1)荧光素酶报告基因实验证实micro RNA-27a可以与PPARγ3’-UTR相结合,即PPARγ是micro RNA-27a的靶基因。2)q PCR结果显示:酒精处理后,酒精模型组和NC组BMSC中PPARγm RNA表达量均高于空白对照组和micro RNA-27a组(P0.01),空白对照组和micro RNA-27a组比较,以及酒精模型组和NC组比较差异均无统计学意义(P㧐0.05);与此相反,酒精模型组和NC组BMSC中Runx2 m RNA表达量均低于空白对照组和micro RNA-27a组(P0.01),空白对照组与micro RNA-27a组比较,以及酒精模型组和NC组比较差异均无统计学意义(P㧐0.05)。3)ALP检测结果显示:与空白对照组比较,酒精模型组和NC组BMSC经酒精处理后ALP含量均有下降,差异具有统计学意义(P0.01),而micro RNA-27a组中ALP含量与空白对照组近似,差异无统计学意义(P㧐0.05)。4)I型胶原检测结果显示:与空白对照组比较,酒精模型组和NC组BMSC经酒精处理后I型胶原含量均有下降,差异具有统计学意义(P0.01),而micro RNA-27a组中I型胶原含量与空白对照组近似,差异无统计学意义(P㧐0.05)。5)OCN检测结果显示:酒精模型组和NC组培养液中OCN的含量与空白对照组及micro RNA-27a组比较均有下降,差异具有统计学意义(P0.01)。空白对照组与micro RNA-27a组比较,差异无统计学意义(P㧐0.05)。6)Western blot结果显示:酒精模型组和NC组与空白对照组比较BMSC中PPARγ的蛋白表达量明显上升(P0.01),micro RNA-27a组PPARγ蛋白表达水平与空白对照组接近,差异无统计学意义(P㧐0.05)。同时,酒精模型组和NC组与空白对照组比较BMSC中Runx2的蛋白表达量明显下降(P0.01),micro RNA-27a组Runx2蛋白表达水平与空白对照组差异无统计学意义(P㧐0.05)。7)脂肪染色及脂肪细胞计数结果:油红O染色显示,空白对照组和micro RNA27a组细胞中罕见脂滴生成且极少出现脂肪细胞;酒精模型组及NC组细胞,胞质内出现较多脂肪滴且有大量脂肪细胞生成,着色后呈棕红色。脂肪细胞计数结果显示,酒精模型组和NC组脂肪细胞生成数比micro RNA-27a组和空白对照明显增多,差异具有统计学意义(P0.01);空白对照组与micro RNA-27a组比较,差异无统计学意义(P㧐0.05)。8)TG含量测定结果显示,酒精模型组和NC组表达含量均高于空白对照组与micro RNA-27a组,差异具有统计学意义(P0.01)。空白对照组与micro RNA-27a组比较,差异无统计学意义(P㧐0.05)。结论:1.micro RNA27a能够靶向调节PPARγ基因,下调BMSC中PPARγ基因的表达,减少脂肪细胞生成,降低细胞中TG的含量,抑制酒精诱导的BMSCs成脂分化能力。2.BMSCs细胞中Runx2基因表达的升高,ALP活性、I型胶原和OCN含量的增加,促进BMSCs成骨分化。3.micro RNA27a在预防酒精性ONFH发生中发挥一定作用。
[Abstract]:Bone marrow stromal cells ( BMSC ) are a key factor in the development of bone marrow stromal cells ( bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells and neural cells ) . Objective : To investigate the effect of micro RNA - 27a on PPAR纬 gene expression and to investigate the effect of micro RNA - 27a on PPAR纬 gene expression . Compared with blank control group , the expression of PPAR纬 mRNA in the alcohol model group and NC group was significantly higher than that in blank control group ( P0.01 ) . Conclusion : 1 . MicroRNA27a can regulate PPAR纬 gene , decrease the expression of PPAR纬 gene in BMSC , decrease the expression of PPAR纬 gene in BMSC , decrease the expression of PPAR纬 gene in BMSC , decrease the expression of PPAR纬 gene in BMSC , decrease the content of TG in BMSC , inhibit the increase of activity of ALP , type I collagen and OCN , and promote the differentiation of bone into bone . 3 . MicroRNA27a plays a role in preventing alcoholic ONFH .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R681.8

【参考文献】