大鼠SLPI基因重组载体构建及其调控真皮多能干细胞增殖的作用研究

发布时间：2018-04-25 17:18

本文选题：分泌型白细胞蛋白酶抑制因子 + 重组表达载体　；参考：《第三军医大学》2015年硕士论文

【摘要】：利用干细胞技术进行创面修复机制及促愈研究已成为创伤领域研究的热点之一。其中成体干细胞由于所受伦理限制则较少,并具有明显的多向分化潜能,因此与之相关的研究数量众多,并且应用前景广阔。成体干细胞可有多种来源,包括骨髓、脂肪、胰岛、皮肤及神经组织等。由于皮肤组织更新速度快,再生能力强,加之取材方便,用于皮肤等软组织创面修复具有相容性好等特点,因此,从局部皮肤获得的成体干细胞在对创面修复的过程中发挥的作用更加显著。有研究结果表明,真皮组织中同样存在干细胞,其起源于间质细胞,这类细胞的增殖能力较强,并且能够转化为多种细胞,如平滑肌细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞以及脂肪细胞等。这种类型的细胞再生能力强,是一种多能的干细胞种类,被称为真皮多能干细胞。我们前期研究结果发现,创面早期伤口液对真皮多能干细胞具有明确的促增殖作用;整体动物实验表明,皮肤切割伤大鼠移植真皮多能干细胞可以缩短创伤愈合时间,对创面修复,包括合并放射性损伤的难愈性创面都具有很好的促愈治疗效果。这些结果提示,真皮多能干细胞参与了创面修复过程,是促进创面愈合的一种重要修复细胞成分,并且真皮多能干细胞增殖是其促进创面修复的重要途径。分泌型白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)是一种可以对抗各种丝氨酸蛋白酶活性的蛋白,其氨基末端具有抗真菌、抗炎及抗菌等方面的活性,而其羧基末端在抑制糜蛋白酶等方面有良好活性表现。有研究表明,SLPI还具有促细胞增殖作用,也参与细胞凋亡和免疫功能的调节作用,具有抑制细胞凋亡和调节免疫反应等功能。SLPI的这些生物学作用在某种意义上来说和创面修复过程之间有着紧密的内在联系。通过以往研究我们已经发现,真皮多能干细胞在创面早期伤口液的刺激下增殖速度明显增加;在基因芯片技术和抑制消减杂交技术的帮助下我们发现,在创面早期伤口液作用下,真皮多能细胞表达SLPI含量明显增加;并且创伤局部组织SLPI同样呈高表达;提示SLPI可能通过促真皮多能干细胞增殖作用来发挥调节创面修复过程。为进一步证实SLPI在促真皮多能干细胞增殖的作用,本实验拟构建SLPI基因表达载体和SLPI基因si RNA表达载体,通过RT-PCR、western bolt鉴定,并运用CCK-8法和流式细胞术检测细胞周期,以探明SPLI促进真皮多能干细胞的增殖作用及可能机制。本实验对创面修复的研究具有理论意义和潜在的应用价值。主要结果和结论如下:1.本实验中分离的真皮多能干细胞具备形态单一性,细胞被分离之后仍然具备较强的增殖能力,并且能够在外界因素的影响下向脂肪细胞、成骨细胞或者肌细胞等类型转化。这些结果提示,本实验成功分离并扩增出大鼠真皮多能干细胞,并证实其具有自我更新和多向分化潜能。2、通过分子生物学技术成功构建SLPI基因过表达载体,根据SLPI基因si RNA的设计挑选出最佳沉默SLPI基因表达载体,并通过RT-PCR、Western bolt鉴定所构建载体,有助于从正反两个方面来证实SLPI基因的作用。3、SLPI基因重组表达载体成功转染真皮多能干细胞,并将其分为过表达组、干扰组和对照组;检测CCK-8表达结果显示,SLPI基因有促进真皮多能干细胞增殖作用。流式细胞检测细胞周期结果表明,过表达组真皮多能干细胞G1期与干扰组比较有显著性差异,G2与S期与对照比较有显著性差异,SLPI基因具有促使真皮多能干细胞从G1向S和G2期转变,即SLPI基因通过调控真皮多能干细胞周期来发挥促增殖作用,这些结果证实了SLPI在创面修复过程中的作用,并初步探讨了其作用环节和途径。
[Abstract]:The present study shows that there are many kinds of stem cells , such as smooth muscle cells , neuron cells , glial cells , fibroblasts and adipose cells . The expression vector of SLPI gene expression vector and SLPI gene were successfully transfected by RT - PCR and Western bolt . The results showed that SLPI gene could promote the proliferation of dermal multipotent stem cells . The results showed that SLPI gene could promote the proliferation of dermal multipotent stem cells .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R641

【相似文献】