RAGE中和抗体缓解腰5脊神经结扎大鼠的神经病理性疼痛的研究

发布时间：2018-04-28 14:44

  本文选题：神经病理性疼痛 + 晚期糖化终末产物受体　； 参考：《第二军医大学》2015年硕士论文

【摘要】：研究背景和目的：由创伤、感染、神经病变、代谢性或炎症性疾病、药物副作用等多种因素所导致的神经病理性疼痛严重影响患者的生活质量。神经病理性疼痛形成机制复杂,涉及神经元伤害性感受器敏化、痛觉传导通路的多种离子与蛋白偶联受体及信号分子失调、非神经细胞(如胶质细胞)的异常激活、免疫细胞浸润、以及多种致痛因子如ATP、谷氨酸盐、活性氧、促炎细胞因子、趋化因子、缓激肽、前列腺素、P物质、神经营养因子等的释放。晚期糖基化终末产物受体(the recepotr for advanced glycation end products,RAGE),是一种表达在细胞膜表面的免疫球蛋白超家族蛋白受体。最近的研究表明RAGE参与多种神经系统疾病的发生和发展,其主要的机制为增加氧化应激的水平和加剧免疫炎症反应。在中枢神经系统,大量堆积的RAGE配体可促进胶质细胞活化,活化的胶质细胞释放大量炎症因子,如IL-6、TNF-α和IL-1p等,使组织炎症发应放大。神经元上的RAGE激活,使细胞内活性氧(ROS)大量生成,导致神经元的逐渐凋亡。ROS和炎症因子导致神经毒性,形成恶性循环,长期持续存在会导致神经功能紊乱。在外周神经轴突损伤后,RAGE可调控单核巨噬细胞的迁移并浸润在损伤轴突远端,与神经元表达的RAGE共同作用促进受损神经轴突芽生,有利于神经的重建,恢复传导功能。而长期过表达RAGE介导神经元轴突的脱髓鞘病变,导致轴突转导功能障碍。RAGE/NF-κB作为重要信号通路介导外周神经损伤已被大量研究所证实,RAGE基因敲除糖尿病模型小鼠中NF-κB活化减少,感觉传导纤维数量比对照组明显增加。RAGE的阻断剂可缓解外周感觉神经纤维的低敏症状,过表达RAGE则能进行性加重外周神经症状。由于胶质细胞活化和炎症因子释放都是疼痛信号传导通路上的重要环节,因此RAGE在神经系统与疼痛发生的关系有待进一步明确。目前RAGE在神经病理性疼痛方面相关的研究较少,为明确RAGE在神经病理性疼痛发病中的作用,我们建立大鼠脊神经结扎模型,观察RAGE在背根神经节和脊髓背角的表达。通过鞘内注射RAGE中和抗体镇痛作用的研究,检测其下游NF-κB和TNF-a和IL-1p的表达,以及GFAP和Wntl蛋白的表达,探讨其在背根神经节发挥作用的可能机制。这一研究可为临床治疗神经病理性疼痛提供新的思路,同时也对炎症机制参与的急性神经损伤提供借鉴和参考。研究方法：雄性SD大鼠,体重200-250g,采用结扎腰5脊神经(L5)制备模型(SNL)。取脊髓和背根神经节组织,用免疫组化荧光染色和Westernblot分别检测术后1d,3d,7d的RAGE的表达情况。将大鼠随机分为三组,分别为药物组：SNL术后每天鞘内注射RAGE中和抗体；对照组：假手术+磷酸缓冲盐溶液；安慰剂组：SNL术+磷酸缓冲盐溶液。于术前及术后1d,3d,5d,7d测定大鼠的机械撤爪阚值(PWT)和热刺激缩爪潜伏期(PTWL)。取术后7d大鼠背根神经节,Westernblot分别检测NF-κB、GFAP和Wnt蛋白的表达,采用ELISA检测各组中TNF-a和IL-1p的表达。研究结果：免疫组化荧光提示,背根神经节RAGE在SNL后3d和7d相比正常对照组表达增高(P0.05),且表达在卫星胶质细胞和神经元。Western blot提示,背根神经节RAGE在SNL后1d,3d和7d表达较术前表达增高(P0.05)；脊髓背角RAGE表达在SNL后1d,3d和7d与正常对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。行为学结果提示,与对照组相比,安慰剂组术后1d,3d,5d,7d的PWT降低(P0.05)；药物组术后1d,3d,5d,7d的PWT降低(P0.05)。与安慰剂组比较,药物组术后3d,5d,7d的PWT增加(P0.05)。与对照组相比,安慰剂组术后1d,3d,5d,7d的PTWL降低(P0.05)；药物组术后1d,3d,5d,7d的PTWL降低(P0.05)。与安慰剂组比较,药物组术后3d,5d,7d的PTWL增加(P0.05)。鞘内注射RAGE中和抗体提高了大鼠术后3d、5d、7d的机械缩爪阈值和热刺激缩爪潜伏期。采用Western blot测定SNL术后7d背根神经节NF-κB、GFAP和Wnt蛋白结果提示：与对照组比较,安慰剂组NF-κB (0.80±0.04 vs 0.31±0.02, P0.05)、GFAP (1.46±0.04 vs 0.32±0.08,P0.05)表达明显增加；Wntl(0.41±0.04 vs.2.47±0.12,P0.05)表达降低。与对照组比较,药物组术NF-κB≥(0.51±0.03 vs.0.31±0.02,P0.05).GFAP(0.69±0.06 vs.0.32±0.08,P0.05)表达明显增加；Wntl(0.93±0.17 vs.2.47±0.12,P0.05)表达降低。药物组术后的NF-κB(0.51±0.03 vs.0.80±0.04,P0.05).GFAP (0.69±0.06 vs.1.46±0.04,P0.05)较安慰剂组表达降低；Wntl(0.93±0.17vs. 0.41士0.04,P0.05)表达增高。采用ELISA法测定术后7天背根神经节TNF-α和IL-1β水平提示：与对照组比较,安慰剂组TNF-α(109.9±4.97 vs.40.18±3.13, P0.05)、IL-1β(168.77±6.34 vs.58.12±3.11,P0.05)表达明显增加。与对照组比较,药物组TNF-α(70.53±6.57 vs.40.18±3.13,P0.05).IL-1β(88.24 ±3.6v s.58.12±3.11,P0.05)表达明显增加。药物组术后的TNF-α(70.53±6.57 vs.109.9±4.97,P0.05).IL-1β(88.24±3.6 vs.168.77±6.34,P0.05)较安慰剂组表达水平降低。研究结论：RAGE在大鼠SNL后的背根神经节表达增加,参与了神经病理性疼痛的发生。鞘内给予RAGE抗体有效的缓解了大鼠的痛敏症状并且抑制了卫星胶质细胞的活化,降低NF-κB和TNF-α和IL-1p表达,增加Wntl蛋白的表达。综上所述,背根神经节内RAGE与神经病理性疼痛的发病密切相关。
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本文编号：1815706