siRNA作用于Vimentin抑制大鼠脊髓伤后胶质瘢痕形成的研究

发布时间：2018-05-01 20:35

  本文选题：小干扰RNA + 中间丝波形蛋白　； 参考：《天津医科大学》2015年博士论文

【摘要】：【目的】设计筛选si RNA干扰中间丝波形蛋白(Vimentin)序列,观察si RNA-Vimentin对脊髓损伤后反应性星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)和硫酸软骨素蛋白多糖(Chondroitin Sulfate Proteoglycans,CSPG)表达的影响,分析其对脊髓损伤大鼠后肢运动功能和神经电生理功能恢复的作用,及其对脊髓组织GFAP、CSPG和Vimentin的表达及胶质瘢痕形成的影响。探讨si RNA作用于Vimentin在脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生和胶质瘢痕形成过程中所起的作用。【方法】设计3条Vimentin干扰序列,并利用Western Blot及RT-PCR筛选出沉默效果相对较好的序列;初生SD乳鼠分离培养皮质星形胶质细胞,并经差速贴壁等方法纯化,GFAP免疫化学荧光鉴定获得星形胶质细胞。将细胞分为正常培养AS组、空载质粒处理阴性对照组和si RNA-Vimentin转染组,进行细胞划痕实验、MTT法测定各组细胞增殖能力,免疫荧光化学染色及RT-PCR验证si RNA作用于Vimentin对脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成的影响及GFAP、CSPG和Vimentin之间的相互作用。同时,采用改良Allen垂直打击法制备SD大鼠脊髓胸10(T10)脊髓损伤动物模型,并将实验动物随机分为三组:假手术组(30只)、阴性对照组(30只)和si RNA-Vimentin组(30只),于造模同时假手术组注射DMEM/F 12培养基5μl,阴性对照组注射DMEM/F 12培养基+空载质粒5μl,si RNA-Vimentin组注射DMEM/F 12培养基+si RNA-Vimentin质粒5μl。分别于术后24h、1w、2w、4w、8w和12w进行BBB评分,并于术后24h和12w进行SEP、MEP测定;术后4w取各组脊髓组织进行RT-PCR测定GFAP、CSPGs和Vimentin表达情况;术后12w取各组脊髓组织计算各组胶质瘢痕体积。收集以上各数据进行统计学分析。【结果】设计筛选的3条si RNA干扰序列中,si RNA-Vimentin-1073相对沉默效果最好,转染效率最高为转染后24h,细胞转染效率80%;原代分离培养的SD大鼠皮质星形胶质细胞纯化后,经GFAP胞浆免疫荧光染色及DAPI细胞核染色,随机选取6个视野观察,GFAP阳性细胞百分比约为(96.14±1.03)%;星形胶质细胞划痕实验,si RNA-Vimintin组2d/0d宽度比为(0.74±0.17),数值明显为高(P0.05),与MTT结果共同提示si RNA作用于Vimintin对反应性胶质细胞增生有抑制作用;各组细胞免疫荧光染色积分光密度(IOD)和Western Blot检测si RNA-Vimintin转染星形胶质细胞后GFAP、CSPG及Vimentin的表达同时下调,与正常培养星形胶质细胞组和空载质粒阴性对照比较,差异有统计学意义(P0.05);术后8w、12w si RNA-Vimentin组BBB评分提高较为明显(P0.05);术后12w,si RNA-Vimentin组SEP、MEP与其他各组比较改善较为明显(P0.05);术后12w,损伤早期局部注射si RNA-Vimentin的脊髓损伤大鼠模型组,胶质瘢痕体积较对照组明显较小(P0.05)。术后4w各组RT-PCR检测结果显示,si RNA-Vimentin组脊髓组织中GFAP、CSPG和Vimentin表达均显著下调。【结论】si RNA作用于Vimentin能够下调星形胶质细胞表达GFAP、CSPG,从而抑制反应性星形胶质细胞增生;脊髓损伤早期局部注射si RNA-Vimentin可以使脊髓损伤部位GFAP、CSPG和Vimentin表达下调,三者协同发挥作用,抑制脊髓损伤后胶质瘢痕的形成,为脊髓损伤后轴突再生及神经功能恢复提供良好的微环境。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of siRNA - Vimentin on the expression of GFAP , GFAP and chondroitin sulfate in spinal cord injured rats after spinal cord injury . Methods : Three vimentin disturbance sequences were designed by Western Blot and RT - PCR . The effects of proliferation and glial scar formation in spinal cord of SD rats were determined by Western Blot and RT - PCR . The results showed that the cells were divided into three groups : sham operation group ( 30 ) , negative control group ( 30 rats ) and si RNA - Vimentin group . Compared with control group , the expression of GFAP , CUE and Vimentin in spinal cord tissue was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2

【共引文献】

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本文编号：1830950