大鼠脊髓损伤后TNF-α和Prdx6的表达变化研究

发布时间：2018-05-23 18:42

  本文选题：脊髓损伤 + TNF-α　； 参考：《成都医学院》2015年硕士论文

【摘要】：目的观察大鼠脊髓钝挫后氧化损伤的程度,研究肿瘤坏死因α(TNF-α)和过氧化物氧化还原酶6(Prdx6)在基因水平和蛋白水平上的表达变化,及其对脊髓损伤后运动功能恢复的影响,探讨炎症损伤和氧化损伤对脊髓二次损伤和脊髓损伤后运动功能恢复的影响。方法本实验随机将153只SD大鼠分成脊髓损伤组和假手术组。采用改良的Allen’s方法在T9脊髓节段制备脊髓损伤模型;假手术组动物只打开椎板,不伤脊髓;建模后用BBB方法评价脊髓损伤的功能恢复情况。采用脊髓组织芯片制备技术制作脊髓组织切片,将假手术组和损伤后不同时间点的组织放置在同一张切片中进行HE染色和免疫组织化学染色观察。利用MDA和SOD试剂盒分别测定损伤后2h,6h,12h,1d,3d,5d及7d大鼠血清内自由基含量和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性。采用酶免疫组织化学技术和免疫荧光技术确定TNF-α和Prdx6在细胞内的定位表达。采用Q-PCR的方法探究在SCI后TNF-α和Prdx6基因水平的表达变化;采用WB免疫蛋白印迹研究SCI后TNF-α和Prdx6蛋白的表达变化。应用生物信息学方法探索TNF-α和Prdx6基因之间是否具有联系。运用SPSS Statistics17.0统计学软件进行分析,采用单因素方差分析来比较均值,以P0.05作为检验标准。结果(1)BBB评分结果:本实验用改良的Allen’s方法成功建立大鼠脊髓钝挫伤型脊髓损伤模型。BBB评分结果显示,在脊髓钝挫伤后,模型组大鼠产生明显的运动神经功能障碍,术后各个时间点,模型组大鼠BBB评分显著低于假手术组(P0.05)。在术后1d和3d,大鼠后肢运动功能明显障碍,仍处于完全瘫痪的状态。随着时间的推移,我们观察到模型组大鼠后肢运动功能在损伤后的7d开始恢复,14d时BBB评分显著升高(与术后1d相比,有明显统计学意义,P0.05),提示脊髓钝挫伤后损伤脊髓仍具有一定的可塑性。(2)HE染色病理结果:假手术组脊髓组织完整,细胞形态正常,胞核和胞质染色清晰。损伤后的脊髓组织在脊髓背侧金属棒打击部位出现组织坏死,损伤早期,脊髓组织呈现出血、水肿、结构紊乱等一系列病理学变化。损伤后3d,脊髓灰质前角神经元发生肿胀、核固缩;损伤后7d,大量的炎性细胞开始浸润,持续至28d后开始消退。(3)脊髓损伤后,MDA在损伤后立即上升,在损伤后5d达高峰;而SOD的活性在SCI后持续下降,至伤后2h最低,随后稍有上升,但至伤后7d仍明显低于假手术组水平(P0.05)。(4)免疫组织化学技术结果显示:TNF-α在脊髓神经细胞的胞核与胞浆内均有表达,在神经元主要以胞质表达为主,在神经胶质细胞主要以细胞核为主。在正常脊髓组织中,TNF-α微量表达;SCI后,在脊髓灰质中,TNF-α主要分布于前角运动神经元的胞质中,少量表达于神经胶质细胞胞质和胞核内;而在白质,TNF-α则大量表达于神经胶质细胞的胞质和胞核内及神经纤维中。Prdx6在正常脊髓组织的灰质前角的神经胶质细胞的胞核和胞质内均有明显表达,在神经元中表达较少;免疫荧光发现,TNF-α和Prdx6都在脊髓灰质前角的神经元和神经胶质细胞中都表达。SCI后6h,Prdx6的表达明显减少;至损伤后5d,Prdx6在脊髓前角的表达增加,继而在7d时下降,在这个过程中,Prdx6的表达量始终是低于假手术组水平的。(5)Q-PCR结果显示:与假手术组相比,TNF-α的基因水平在SCI后6h、1d和14d呈显著性上升(P0.05)。然而,在SCI后,Prdx6的m RNA水平却呈现持续性的下降。(6)WB结果显示:与假手术组相比,TNF-α蛋白表达在脊髓损伤后12h时明显上升(P0.05),此后,1d,3d和7d与假手术组相比仍然升高。与假手术组相比,Prdx6蛋白表达在脊髓损伤后呈现持续性下降(P0.05)。(7)生物信息学方法提示TNF-α和Prdx6基因之间通过活性转录因子3(Activating Transcription Factor,ATF3)和活性转录因子4(Activating Transcription Factor4,ATF4)产生间接的联系。结论本实验首次观察到,在脊髓损伤后,过氧化物氧化还原酶6(Prdx6)基因和蛋白降低,Prdx6在脊髓前角运动神经元表达。本实验用生物信息学方法观察到TNF-α和Prdx6之间具有相互联系,TNF-α和Prdx6共同参与了脊髓损伤后的病理过程,与急性脊髓损伤的发生发展有关,对脊髓损伤运动功能的恢复具有重要意义。本实验观察到在脊髓损伤后,丙二醛MDA和炎症因子TNF-α在脊髓损伤后立即上升,提示炎症反应和氧化损伤共同存在,相互作用,是促进脊髓二次损伤的重要因素。TNF-α的基因水平在SCI后6h上升至峰值,其蛋白水平在SCI后12h达到最高水平,而此时脊髓运动功能评分最低,几乎为0;在SCI后7d时,TNF-α的基因水平和蛋白水平均有所降低,此时,BBB评分较之前升高有统计学意义,提示TNF-α是影响脊髓运动功能恢复的因素。因此,TNF-α具有促进脊髓早期炎症反应和抑制脊髓损伤运动功能恢复的作用,Prdx6具有抗氧化反应和促进脊髓运动功能的恢复的作用,他们可以作为脊髓损伤的治疗靶点,为临床脊髓损伤治疗提供新的选择。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of TNF - 伪 and Prx 6 in spinal cord injury in rats after spinal cord injury , and to investigate the effect of inflammatory injury and oxidative damage on spinal cord injury after spinal cord injury . ( 2 ) The pathological results of HE staining showed that the spinal cord tissue was intact in the sham operation group , the cell morphology was normal , the nucleus and the cytoplasm were stained clearly . ( 5 ) The results of Q - PCR showed that the mRNA level of TNF - 伪 increased significantly at 6h , 1d and 14d after SCI ( P0.05 ) . (7)鐢熺墿淇℃伅瀛︽柟娉曟彁绀篢NF-伪鍜孭rdx6鍩哄洜涔嬮棿閫氳繃娲绘，

本文编号：1925887