脂多糖激活TLR4信号通路对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响研究

发布时间：2018-06-03 10:23

  本文选题：脂多糖 + Toll样受体4　； 参考：《重庆医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:分析脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号通路对BMP9诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响,并探讨其可能的影响机制。方法:首先通过RT-PCR和Western blot检测MSCs中TLR4的内源性表达;再用Ad-GFP和Ad-BMP9感染MSCs后通过Western blot检测TLR4表达变化,通过RT-PCR检测TLR4下游靶基因IL-1β和IL-6表达变化;之后在Ad-GFP和Ad-BMP9感染的MSCs中加入LPS,分别检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、钙盐沉积、晚期成骨标志基因骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达变化、Smad1/5/8信号通路激活情况和成骨关键转录因子runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达变化;随后在N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)预处理MSCs后,加入LPS,通过DCFH-DA法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)变化,通过Western blot检测抗氧化相关因子Nrf2、SOD1和SOD2的表达变化;然后在BAY11-7082预处理MSCs后加入LPS,用DCFH-DA法检测细胞内ROS变化;最后用BAY11-7082和NAC预处理Ad-GFP和Ad-BMP9感染的MSCs,再加入LPS,分别检测ALP、钙盐沉积、OPN的表达变化、Smad1/5/8信号通路激活情况和Runx2的表达变化。结果:TLR4在3种MSCs中均有表达;外源性过表达BMP9可以抑制TLR4的表达,但不影响IL-1β和IL-6表达;LPS激活TLR4信号通路抑制BMP9诱导的ALP活性、钙盐沉积、OPN表达、Smad1/5/8信号通路的激活和Runx2的表达;LPS激活TLR4信号通路增加MSCs中ROS;BAY11-7082可以阻断LPS激活TLR4信号通路导致的MSCs中ROS增加;BAY11-7082和NAC均可以部分逆转LPS激活TLR4信号通路后对BMP9诱导的ALP活性、钙盐沉积、OPN表达、Smad1/5/8信号通路的激活和Runx2的表达的抑制。结论:LPS激活TLR4可以通过NF-κB/ROS抑制BMP9诱导MSCs成骨分化。
[Abstract]:Aim: to investigate the effect of lipopolysaccharide (LPS) activation of Toll like receptor 4(Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathway on mesenchymal stem cells differentiation induced by BMP9, and to explore its possible mechanism. Methods: the endogenous expression of TLR4 in MSCs was detected by RT-PCR and Western blot, then by Western blot after MSCs infection with Ad-GFP and Ad-BMP9, IL-1 尾 and IL-6 were detected by RT-PCR, and IL-1 尾 and IL-6 were detected by RT-PCR. After adding LPSs to MSCs infected with Ad-GFP and Ad-BMP9, alkaline phosphatase (ALP), alkaline phosphatase (ALP) and calcium deposition were detected, respectively. Expression of osteopontin (osteopontinine), a late osteopontin marker gene, the activation of Smad1 / 5 / 8 signaling pathway and the expression of 2(runt-related transcription factor 2 / Runx2, a transcription factor associated with osteogenic key transcription factor (runt), followed by pretreatment of MSCs with N-acetyl-L-cysteine NAC- (N-acetyl-L-cysteine). The changes of reactive oxygen speciess-ROS in cells were detected by DCFH-DA, the expression of Nrf2SOD1 and SOD2 were detected by Western blot, and the changes of ROS were detected by DCFH-DA after BAY11-7082 pretreatment with MSCs. Finally, Ad-GFP and Ad-BMP9 infected MSCs were pretreated with BAY11-7082 and NAC, and then LPSs were added to detect the expression of ALP, Ca ~ (2 +) ~ (2 +) and OPN. The activation of Smad1 / 5 / 8 signaling pathway and the expression of Runx2 were detected. Results: TLR4 was expressed in all three kinds of MSCs, exogenous overexpression of BMP9 could inhibit the expression of TLR4, but it did not affect the expression of IL-1 尾 and IL-6. LPS-activated TLR4 signal pathway inhibited ALP activity induced by BMP9. Activation of Smad1 / 5 / 8 signaling pathway and Runx2 expression LPS-activated TLR4 signaling pathway increased ROSBAY11-7082 in MSCs by blocking ROS increase in MSCs induced by LPS activation of TLR4 signaling pathway and partial reversal of LPS activated TLR4 signaling pathway induced by LPS activation of TLR4 signaling pathway ALP activity induced by BMP9, The activation of Smad1 / 5 / 8 signaling pathway and the inhibition of Runx2 expression. Conclusion TLR4 activated by TLR4 can inhibit the osteogenic differentiation of MSCs induced by BMP9 through NF- 魏 B/ROS.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R68

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本文编号：1972444