HDAC3在H9C2细胞缺血再灌注损伤中的表达及TSA干预机制
本文选题：体外循环 + 缺血再灌注损伤 ； 参考：《安徽医科大学》2017年硕士论文
【摘要】：目的缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,I/R)是指部分组织细胞经历了此阶段,恢复血流和氧供后,组织损伤却更为加重,发生组织结构破坏和功能代谢障碍的不可逆损伤现象,但发病机制尚不清楚。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDACs)参与IR发病过程。HDACs可将基因的表达激活,调控染色质结构和基因表达,使组蛋白去乙酰化,去乙酰化则在转录阻遏过程中起作用,不同亚型的HDACs发挥不同的功能作用。曲古霉素A(Trichostatin A,TSA)作为HDACs的抑制剂,是被发现的第1个能抑制HDAC活性以及已知最为有效的化合物。本实验探究HDAC3在细胞缺血再灌注损伤中的作用,TSA通过调控干预H9C2心肌细胞IR损伤中的表达,并进行HDAC3部分机制研究,为临床防治再灌注损伤提供新思路和新的研究途径。方法选取SD大鼠H9C2细胞株进行研究,置于正常培养箱中,选取对数生长期细胞,采用EDTA胰酶液制成细胞悬液后,进行细胞传代和接种。本实验分为以下3组:(1)正常对照组、(2)缺血/再灌注(I/R)组、(3)缺血/再灌注(I/R)+TSA组;参阅相关文献,模拟心肌细胞I/R过程,进行实验。根据以上分组,每组各设6个复孔。将H9C2心肌细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板,待细胞贴壁3 h后吸出培养液,正常对照组、I/R组、I/R+TSA组每孔各加入200μL DMEM细胞培养液,各组细胞经处理后继续培养。MTT法检测H9C2细胞增殖活力;检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平;Western Blotting法测定H9C2细胞内HDAC3蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测H9C2细胞HDAC3 mRNA表达情况。结果MTT法检测结果显示:与正常对照组相比较,I/R组、I/R+TSA组抑制率均显著提高,并且I/R显著高于I/R+TSA组;I/R组LDH活性明显高于正常对照组,I/R+TSA组显著低于I/R组;Western blotting检测显示I/R组、I/R+TSA组HDAC3蛋白表达明显高于正常对照组,I/R+TSA组显著低于I/R组;实时荧光定量PCR检测组、I/R+TSA组HDAC3的mRNA表达明显高于正常对照组,I/R+TSA组显著低于I/R组。结论通过检测心肌细胞增殖活性、细胞外LDH含量证实了缺血再灌注对心肌细胞活力的影响。与正常对照组比较,I/R组、I/R+TSA组中HDAC3 mRNA以及蛋白表达明显增加。抑制组蛋白去乙酰化酶后,可以减轻缺血再灌注对心肌细胞的损伤,进一步说明HDAC3表达上调在H9C2细胞缺血再灌注损伤中起重要影响,为临床今后研究缺血再灌注损伤研究和处理提供新的思路。
[Abstract]:Objective ischemia reperfusion injury (ischemia reperfusion injury, I/R) means that some tissue cells have experienced this stage, after the recovery of blood flow and oxygen supply, the tissue damage is more aggravated, the damage of tissue structure and the dysfunction of metabolic disorder, but the pathogenesis is not clear. Histone deacetylase (Histone deacetylase). HDACs) in the pathogenesis of IR,.HDACs can activate the expression of gene, regulate chromatin structure and gene expression, make histone deacetylation, deacetylation play a role in the process of transcription repression, and different subtypes of HDACs play different functional roles. As the inhibitor of HDACs, as the inhibitor of Trichostatin A, TSA (TSA) is the first found. To inhibit HDAC activity and the known most effective compounds. This study explored the role of HDAC3 in cell ischemia-reperfusion injury, TSA by regulating the expression of IR in H9C2 cardiomyocytes, and conducting part of the mechanism of HDAC3 to provide new ideas and new approaches for the clinical prevention and treatment of reperfusion injury. Method selected H9 of SD rats. The C2 cell line was studied in the normal incubator, selecting the logarithmic growth stage cells and using the EDTA trypsin liquid to make cell suspension to carry out cell subculture and inoculation. The experiment was divided into 3 groups: (1) normal control group, (2) ischemia / reperfusion (I/R) group and (3) +TSA group with blood / reperfusion (I/R); the related literature was used to simulate the I/R process of cardiac myocytes. According to the above group, 6 complex holes were set in each group. The density of H9C2 cardiac myocytes was inoculated to 96 orifice with the density of 1 x 104/ holes. After the cell adherence was 3 h, the culture fluid was sucked out, the normal control group, the I/R group, and the I/R+TSA group were added to 200 uh L DMEM cell culture solution, and the cells of each group continued to train.MTT method to detect the proliferation activity of H9C2 cells after treatment. The level of lactate dehydrogenase (LDH) in the culture medium was detected, the expression level of HDAC3 protein in H9C2 cells was measured by Western Blotting method, and the mRNA expression of HDAC3 in H9C2 cells was detected by real-time quantitative fluorescence quantitative PCR. The results of MTT assay showed that the inhibitory rate of I/R+TSA group was significantly higher than that in the normal control group, and the inhibition rate of I/R+TSA group was significantly higher than that of the normal group. The activity of LDH in group I/R was significantly higher than that in normal control group, and in group I/R+TSA was significantly lower than that in group I/R; Western blotting detection showed that the expression of HDAC3 protein in group I/R+TSA was significantly higher than that of the normal control group, and the I/R+TSA group was significantly lower than that of the I/R group; the real-time fluorescent quantitative PCR test group was significantly higher than the normal control group, and the group of I/R+TSA was significantly lower than the normal control group. In group I/R. Conclusion by detecting the proliferative activity of cardiac myocytes, the effect of ischemic reperfusion on the viability of myocardial cells was confirmed by the content of extracellular LDH. Compared with the normal control group, the expression of HDAC3 mRNA and protein in group I/R+TSA was significantly increased. After the inhibition of histone deacetylase, the damage of myocardial cells could be reduced by ischemia and reperfusion. This further illustrates that up regulation of HDAC3 expression plays an important role in H9C2 cell ischemia-reperfusion injury and provides a new idea for the study and treatment of ischemia-reperfusion injury in the future.
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R654
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，本文编号：2060607
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