Neuroleukin在关节软骨的表达及其对软骨细胞增殖和基质分泌影响的研究

发布时间：2018-10-10 16:54

【摘要】：关节软骨是由软骨细胞和细胞外基质构成的无血管组织,由于没有血供,自身修复能力较差,关节软骨损伤的修复一直是关节外科的治疗难题。尽管用于临床治疗软骨缺损的手段很多,但是远期效果都不很理想,而且关节软骨的增殖能力差,长期的体外培养扩增时间均导致了软骨细胞的体外去分化,从而形成无功能性的纤维软骨,大大影响了组织工程软骨的修复效果。Neuroleukin是一种神经生长因子,也是一种自分泌运动因子(Autocrine motility factor AMF),虽然Neuroleukin/AMF在血管内皮细胞和成纤维细胞有少量研究,但是目前普遍认为Neuroleukin/AMF是一种肿瘤细胞所特异性分泌,并与肿瘤的侵袭,转移,增殖和血管生成相关的多功能蛋白,它同时也作为(Glucose-6-phosphate isomerase GPI)存在于细胞内调节细胞糖代谢。大量研究证明Neuroleukin的这种功能都是通过他的胞膜受体AMFR来介导实现的。然而NLK作为一种多功能蛋白,其在软骨细胞的功能却没有报道。在本研究中,我们探究并证实了AMFR和Neuroleukin在软骨细胞的表达,并且发现Neuroleukin/AMFR表达和关节软骨细胞成熟和分化的有关;并且发现NLK能够促进软骨细胞的增殖以及II型胶原分泌,另外,信号通路的检测证明NLK对软骨细胞的这些作用很可能是通过PI3K和Smads通路介导的。本研究中我们首次发现了Neuroleukin作为一种生理性细胞因子存在并被软骨细胞分泌,并与软骨细胞的分化,成熟有关;而且能够作为细胞外因子通过其胞膜受体AMFR在软骨细胞上也能够行使其促进增殖和分泌基质的功能;我们的结果表明Neuroleukin可能用于自体软骨移植ACI的辅助治疗或者细胞注射等治疗手段,可能为软骨组织工程带来新的治疗途径。实验一Neuroleukin及其受体在关节软骨组织和软骨细胞的表达目的:研究Neuroleukin和其受体AMFR/gp78在关节软骨组织和软骨细胞的表达。方法:选择1月龄大鼠软骨细胞原代培养,利用Western blot检测并且以肿瘤细胞系(B16-F1,HT1080)和血管内皮细胞系,成纤维细胞系(HUVEC,NIH3T3)作为对照探究NLK在关节软骨细胞是否存在,检测正常软骨细胞能否分泌NLK;利用免疫组化方法和免疫荧光/激光共聚焦观察AMFR在细胞膜的表达情况,分析不同月龄大鼠的关节软骨组织内NLK和AMFR的表达差异。结果:Western blot表明NLK生理性存在于软骨细胞,而且NLK/AMFR在肿瘤细胞相对于正常细胞呈现明显高表达;免疫组化表明AMFR存在于软骨细胞膜,并且表层关节软骨的表达远高于肥大软骨细胞的表达;Western blot同样证明NLK不仅能够被肿瘤细胞分泌,也能够被软骨细胞生理性分泌;NLK/AMFR的表达量在1周-4月大鼠关节软骨发育期逐渐增高,而在4月-12月随着关节的成熟和老化退变,其表达量逐渐下降。结论:Neuroleukin作为一种生理性细胞因子存在并被关节软骨细胞分泌,其膜受体AMFR/gp78也被软骨细胞表达;NLK和其受体AMFR/gp78的表达量随着幼龄大鼠关节软骨发育的成熟/老龄大鼠关节软骨的老化退变而逐渐上升/下降。实验二Neuroleukin通过激活PI3K-Cyclin通路促进大鼠关节软骨细胞增殖目的:研究NLK对软骨细胞增殖能力的影响和其机制。方法:设计浓度梯度微流控芯片以观察不同浓度NLK对软骨细胞增殖能力的影响并探究最佳有效浓度,在6天的连续培养中观察NLK能否促进软骨细胞的增殖,并作NLK促增殖作用的最佳浓度筛选;观察在NLK作用下连续培养6天后软骨细胞的形态有无变化。进行细胞周期分布检测,检测NLK对软骨细胞周期分布的影响并分析;Western blot检测NLK作用条件下AMFR的表达情况和PI3K-Akt,MAPK通路及其下游的周期蛋白的表达。结果:NLK能够通过AMFR促进软骨细胞的增殖,并且在NLK作用下连续培养6天后软骨细胞的形态没有明显变化,NLK对软骨细胞的促增殖作用在一定浓度范围内有浓度依赖性升高,在12.85ng/ml时达到最佳有效浓度;NLK促进增细胞周期中增殖软骨细胞的比例,表现为NLK作用条件下S期,G2M期比例升高。NLK的作用明显上调了其受体AMFR在软骨细胞的表达水平,并且NLK通过提高Akt和ERK的磷酸化水平从而影响其下游细胞周期蛋白来促进软骨细胞增殖。结论:NLK能够通过调控PI3K-Cyclin促进关节软骨细胞的体外增殖,NLK的增殖作用是通过NLK/AMFR激活PI3K-Akt及其下游的cyclin蛋白实现的。实验三Neuroleukin通过调控Smad蛋白促进大鼠关节软骨细胞Collagen II合成并抑制其终末分化目的:研究NLK对关节软骨细胞基质蛋白分泌的影响和其机制。方法:设计引物通过Realtime PCR手段检测软骨细胞的特异性基质II胶原蛋白和蛋白多糖在48小时Neuroleukin作用下的m RNA表达水平的变化;并以低血清培养基组作为对照组,通过western blot和免疫荧光检测蛋白水平II型胶原蛋白在NLK作用下48小时及P0-P2连续培养时的表达;通过western blot及免疫荧光检测p-Smad2/3和p-Smad1/5/8蛋白在Neuroleukin作用后的磷酸化水平的变化。结果:Realtime PCR表明Neuroleukin48小时作用下,II型胶原蛋白m RNA表达水平较对照组明显升高,而蛋白多糖GAGs表达的m RNA水平无显著变化;同样NLK作用48小时II型胶原蛋白表达明显升高;并且在免疫荧光检测中,NLK处理组关节软骨细胞相比对照组细胞在P1-P2培养后II型胶原蛋白表达量增高;NLK作用下关节软骨细胞Smad通路中Smad2/3的磷酸化水平较对照组升高,而Smad1/5/8磷酸化水平较对照组下降。结论:NLK能够通过调控Smad蛋白促进大鼠关节软骨细胞特异性基质II型胶原的合成表达,从而在体外维持软骨细胞的表型。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R684

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本文编号：2262553