USP4介导的TGFβ信号转导通路对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

发布时间：2018-10-11 11:47

【摘要】：背景:瘢痕是人体创面修复过程的一种自然产物,其中病理性瘢痕则是皮肤损伤后创面过度修复引起以大量ECM合成及沉积为特征的皮肤纤维化疾病。它主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,其中增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)在临床中非常多见,其表现为突出皮肤表面或呈持续生长的亢奋状态。大量研究表明,TGF-β是促进创面修复及瘢痕形成的关键效应因子,TGF-β的生物活性的发挥主要通过Smads家族介导的。而TGF-β/Smad信号通路主要通过活化的TGF-β与其胞膜TβRII(TGFβ-receptor II)相结合,促使TβRI(TGFβ-receptor I)与TβRII形成受体异聚体,随后TβRI的GS区磷酸化,激活TβRI,与Smad2和Smad3形成TβRI-SARA-Smads复合体,随后将Smad2和Smad3磷酸化,与Smad4形成异源复合物转入细胞核,最终调控成纤维细胞的增值、分化及胶原代谢,促进增生性瘢痕形成。由此可见TβRI是TGF-β/Smad信号通路的关键组分。不仅如此,抑制型蛋白Smad7是TGF-β/Smad信号通路的主要负性调节因子,Smad7通过负反馈调节着正性与负性Smads之间的平衡。近年来研究表明,泛素特异性蛋白酶4(USP4)可增强TGF-β信号通路的水平,但在HS形成中,USP4对TGF-β信号通路的作用还未见报道。本实验就从组织水平及细胞水平研究USP4对瘢痕形成的调控作用,为瘢痕的防治探索新方法。目的:探讨USP4在HS形成中的重要作用,尤其是TGF-β/Smad信号通路的调控作用;通过泛素特异性蛋白酶抑制剂(Vialinin A)抑制USP4表达,明确USP4与TβRI、Smad7的相关性,阐明USP4对增生性瘢痕的作用机制,为临床上利用USP4作为药物作用靶点治疗HS提供重要的理论依据。方法:1、取本院整形外科临床上增生性瘢痕患者的HS标本以及瘢痕周围正常皮肤组织标本15例(伤后6个月~1年内),低温下迅速带回实验室处理;部分组织生理盐水洗净后用4%中性甲醛固定后,常规脱水和石蜡包埋,进行免疫组化检测;部分组织用于Western blot检测人增生性瘢痕组织中USP4及TβRI蛋白表达水平差异,并以正常皮肤组织(Normal tissue,NS)作为对照。2、收集人增生性瘢痕组织及瘢痕周围正常皮肤标本,采用改良组织块联合胰酶消化法体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞(Hypertrophic scar fibroblast,HSFB)和正常皮肤成纤维细胞(Normal skin fibroblast,NSFB)。①取第4代FB(Fibroblast),Western blot检测HSFB与NSFB中USP4、TβRI和Smad7蛋白表达水平;②人增生性瘢痕成纤维细胞铺板培养24h后加入5μmol/LVialinin A(USP4抑制剂),在0h、12h、24 h、48h后收取细胞,运用Western blot再次检测USP4、TβRI及Smad7蛋白的表达水平;③人增生性瘢痕成纤维细胞以每孔1×104/ml密度接种于96孔板培养24h后加入5μmol/L Vialinin A,MTT法检测Vialinin A对HSFB增殖的影响,并以未干预的细胞作为对照。结果:1、免疫组化结果显示:USP4在NS中表皮基底细胞中有少量阳性表达,FB中未见明显阳性表达,在HS中除了表皮基底细胞外,FB胞膜及胞浆中存在大量的阳性表达,两者比较具有差异(P0.01);TβRI在NS中FB中基本不着色,在HS中FB胞膜及胞浆可见大量阳性表达,两者比较具有显著差异(P0.01)。2、Western Blot结果显示:USP4及TβRI在HS高表达,USP4及TβRI在NS表达水平较低,两者比较均具有统计学差异性(P0.05);USP4及TβRI在HSFB中的蛋白表达较NSFB的高((P0.05),而Smad7蛋白在HSFB中低表达(P0.05);加入Vialinin A后,随着时间推移,USP4及TβRI蛋白在HSFB中的表达水平逐渐降低,在作用12h后明显降低(P0.05),Smad7蛋白的表达则逐渐升高(P0.05),进一步证实USP4与TβRI正相关,与Smad7负相关。3、MTT结果显示:加入Vialinin A后的HSFB与未被干预的HSFB相比,增殖活性降低(P0.05)。结论:1、增生性瘢痕组织及细胞中USP4及TβRI蛋白明显增高,Smad7在增生性瘢痕成纤维细胞低表达。2、下调人增生性瘢痕成纤维细胞中USP4表达能够显著降低TβRI的表达,上调Smad7的表达,提示USP4可能通过调控TGF-β/Smad信号通路影响瘢痕组织形成。3、下调人增生性瘢痕成纤维细胞中USP4表达能够使增生性瘢痕成纤维细胞增殖减慢,有望为瘢痕的防治提供新思路。
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【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R622

【参考文献】