雷奈酸锶对内侧半月板切除术诱导豚鼠继发性骨关节炎的作用及机制研究

发布时间：2018-10-16 11:02

【摘要】：第一部分内侧半月板切除术导致豚鼠继发性骨关节炎模型的观察目的:探讨豚鼠内侧半月板切除(medial menisectomy,MNX)后关节炎的发生特点、软骨组织病理变化,来评价骨性关节模型的建立是否成功,为后期实验提供正确的使用模型。方法:1 3月龄雄性DH豚鼠24只,随机将动物分为2组(n=12):Sham组和MNX组,分别行假手术和内侧半月板切除术。2所有动物术后饲养12周处死,利用OARSI关节评分系统对关节退变情况进行评估,利用免疫组化技术对软骨组织中OA相关因子表达水平进行分析,利用Micro-CT技术对胫骨平台侧的软骨下骨进行扫描记录,分析内侧半月板切除术对软骨下骨的作用。结果:1两组动物体重随时间逐渐增长,各时间点两组间体重无显著差异;2 OARSI大体评分结果显示,MNX组评分高于Sham组(MNX组vs.Sham组,2.92±0.20 vs.0.83±0.52,P0.05),差异具有统计学意义;3 MNX组动物术后关节退变严重,OARSI组织学评分显示MNX组总分及CS、PG、CL和OST子项评分均显著高于Sham组(P0.05);4与Sham组相比,MNX动物的胫骨平台软骨负重区AGG表达水平显著下降(P0.001),ADAMTS4(P0.05)、Caspase3(P0.001)和MMP13(P0.05)的表达水平则显著增高。此外,AGG/ADAMTS4比值(P0.05)和Col-II/MMP13比值(P0.05)显著下降,而Col-II/AGG比值显著升高(P0.05)。5 Micro-CT检测结果:MNX组可见关节边缘内侧缘性骨组织增生明显,胫骨上端下骨小梁显著减少。与Sham组相比,MNX组动物胫骨平台软骨下骨BMD显著降低(P0.05),BV/TV、Tb.Th显著降低(P0.05),Tb.Sp和SMI显著增加(P0.05)。第二部分雷奈酸锶对内侧半月板切除术诱导豚鼠关节炎的作用目的:Dunkin-Hartley(DH)豚鼠内侧半月板切除(MNX)导致继发性骨关节炎(osteoarthritis,OA)模型后,早期应用雷奈酸锶(strontium ranelate,SR),探讨SR对MNX豚鼠关节炎的作用。方法:1 3月龄DH雄性豚鼠36只,随机分为三组,每组各12只:MNX+NS组、MNX+CLX组和MNX+SR组,每组再随机分成2个亚组(n=6),一亚组用于大体观察,另一亚组用于组织学观察,适应性饲养1周后对各组进行右膝关节内侧半月板切除术。2术后一周开始给药,MNX+SR组给予SR 625mg/kg/d灌胃,MNX+CLX组给予CLX 20mg/kg/day灌胃,MNX+NS组给予等量生理盐水灌胃。3给药12周后,处死动物并解剖右膝关节。通过肉眼观察胫骨平台和股骨髁的颜色、平滑度、滑液性状和关节表面磨损情况。应用OARSI进行关节大体评分。制备标本切片,进行甲苯胺蓝染色,依据OARSI组织学评分系统对内侧胫骨平台损伤情况及骨赘情况进行评分。结果:1 DH豚鼠随着年龄的增长体重也逐渐增加。12周时MNX+NS组、CLX组和MNX+SR组体重无显著差异,说明SR给药对豚鼠的生长和发育没有显着影响,不影响体重。2软骨的OARSI大体评分:造模术后内侧胫骨平台关节软骨出现了明显的磨损,胫骨内侧平台软骨表面变得粗糙,在软骨的内侧边缘形成裂隙并有软骨增生。给予CLX或SR的豚鼠术侧OARSI大体评分均值较MNX+NS组略有降低,但均未见显著差异。3软骨组织学观察结果:各组软骨均发生严重退变,负重区软骨严重受损,表现为软骨缺失、甲苯胺蓝染色减弱、形成细胞集群、潮线连续中断、关节内侧边缘有骨赘形成。OARSI组织学评分结果显示:MNX+CLX组的总评分均显著低于MNX+NS组(MNX+CLX组vs.MNX+NS组,10.78±1.91vs.17.36±1.92,P0.05),而MNX+SR组总评分与MNX+NS组相比未见显著差异。软骨厚度测量结果显示,MNX+CLX组动物软骨厚度显著高于MNX+NS组(MNX+CLX组vs.MNX+NS组,360.19±38.93μmvs.264.73±58.01μm,P0.05),而MNX+SR组软骨厚度与MNX+NS组相比未见显著差异。此外,MNX+SR组骨赘高度显著高于MNX+NS组(MNX+SR组vs.MNX+NS组,198.18±48.31μmvs.106.86±57.11,P0.05),MNX+CLX组骨赘高度略小于MNX+NS组,但未见统计学差异。4骨赘塌陷的观察:大体观察SR组中有5个样品有塌陷骨赘的表现,而MNX组仅有1个样本表现相同的外观,CLX组未见类似现象,这种变化在三组之间无显著差异。组织学观察SR组有2个样本发生塌陷,结合大体和组织学观察,SR组发生骨赘塌陷的标本为7个,而MNX组仅有1个,两组差异具有统计学意义。第三部分雷奈酸锶对内侧半月板切除术诱导豚鼠关节炎的作用机制探讨目的:通过我们前部分的实验观察,SR并未能起到对关节炎的满意效果,发现其(625mg/kg/day)未能阻止MNX豚鼠软骨的退变,甚至SR的摄入导致关节炎骨赘的增生,甚至塌陷。因此,在本实验通过对SR治疗作用后的关节炎软骨及软骨下骨的进一步研究,来探讨产生这种现象的机制。方法:1 3月龄DH雄性豚鼠36只,随机分为三组,每组各12只:MNX+NS组、MNX+CLX组和MNX+SR组,每组再随机分成2个亚组(n=6),一亚组用于Micro-CT检测,另一亚组用于免疫组化检测,适应性饲养1周后对各组进行右膝关节内侧半月板切除术。2术后一周开始MNX+SR组给予SR 625mg/kg/day灌胃,MNX+CLX组给予CLX 20mg/kg/day灌胃,MNX+NS组给予等量生理盐水灌胃。3给药12周后处死动物,解剖右膝关节,Micro-CT扫描检测胫骨平台软骨下骨,测定骨矿物质密度(BMD)、骨微结构指数(BV/TV),骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁数量(Tb.N),骨小梁分离度(Th.Sp)和结构结构模型指数SMI),各向异性程度(DA)来分析给予CLX和SR对内侧半月板切除后软骨下骨的影响。制备标本切片后,进行免疫组化检测,一抗分别为为:AGG(1:200),ADAMTS-4(1:200),Caspase-3(1:200),Col-II(1:50),和MMP-13(1:200)。结果:1免疫组化结果:三组间AGG、Col-II、Caspase3和MMP13在内侧胫骨平台负重区的表达结果未见显著差异,而MNX+CLX组的ADAMTS4在术侧内侧胫骨平台负重区的表达水平显著低于MNX+NS组(MNX+CLX组vs.MNX+NS组,5243.96±2507.38 vs.11153.19±1958.72,P0.05)。此外,内侧胫骨平台负重区AGG/ADAMTS4表达水平的比值在MNX+CLX组显著高于MNX+NS组(MNX+CLX组vs.MNX+NS组,1.28±0.63 vs.0.45±0.14,P0.05),而Col-II/MMP13和Col-II/AGG两项指标在三组间未见差异。2内侧胫骨平台软骨下骨形态分析:CLX对软骨下骨未造成显著影响,而SR则显著增强MNX豚鼠内侧胫骨平台负重区软骨下骨BMD,并且显著改善了BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp和SMI等形态学参数。结论:1通过切除DH豚鼠右侧膝关节内侧半月板诱发关节退变,主要表现为关节软骨丢失、骨赘形成,软骨基质中以及软骨细胞表达蛋白多糖显著减少,软骨组织中基质成分与基质降解酶类比例失调,软骨细胞表达凋亡相关因子caspase-3增多,与典型的骨关节炎表现类似。同时,DH豚鼠术侧膝关节内侧胫骨平台负重区软骨下骨有明显的骨量丢失,这一表现符合早期骨关节炎软骨下骨的表现。因此,DH豚鼠MNX模型是一种早期骨关节炎模型。2在SR的作用下DH豚鼠MNX模型术侧膝关节内侧胫骨平台负重区软骨下骨的骨密度显著提高,MNX导致的软骨下骨形态改变被显著抑制,但是未观察到SR对MNX导致的关节退变有延缓作用,而目前临床指南推荐用药——塞来昔布表现出对关节退变有一定程度延缓作用。3雷奈酸锶(625mg/kg/day)未能阻止MNX豚鼠软骨的退变,这种结果产生的原因可能是由于SR未能抑制ADAMT4及MMP3的活性、进而未能阻止细胞外基质AGG降解,并且SR未能抑制软骨细胞凋亡的发生以及软骨下骨显著硬化也是SR在本实验中未能对OA软骨起到保护作用的原因。SR的摄入导致骨赘增生,甚至塌陷,这可能与钙化骨赘吸收并促进其增殖的能力有关。未来当骨关节炎进行雷奈酸锶的研究时,这种不利影响应予以重视,因为这可能会掩盖它的治疗效果。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R684.3

【参考文献】