【摘要】：肝脏移植(liver transplantation, LT)经过半个多世纪的发展已经成为挽救无数终末期良恶性肝病患者生命最有效的手段之一。然而,随着肝移植技术的不断进步,越来越长的供体等候队列名单使得很多终末期肝病患者在等待移植的过程中死亡。供体资源紧缺成为包括肝移植在内的实体器官移植所面临的严峻问题。为了扩展供体来源解决供体稀缺问题,包括活体肝移植、劈离式肝移植、心死亡器官捐献(donation after cardiac death, DCD)等技术手段在全世界进行了深入的研究和广泛的开展。其中DCD是目前扩展供体来源最重要的手段之一。从上世纪五十年代DCD供体被最早用于肾移植,到六十年代后因术后并发症和死亡率高的问题而被DBD供体取代,再到九十年代为解决紧张的供受体供需关系而再次被使用并深入展开相关研究,DCD器官移植发展至今已经过了半个多世纪的历史,并取得了十分显著的成果。尽管如此,目前DCD肝移植的预后仍不如DBD肝移植。DCD肝移植术后原发性移植肝无功能(PNF)、缺血性胆道病变(ITBL).肝动脉栓塞(HAT)等严重并发症的发生率显著高于DBD肝移植,移植肝早期失功能一旦发生常常需要再次移植,其治疗费用不但昂贵且手术风险显著提高。因此,如何降低DCD肝移植术后并发症的发生率,提高患者及移植物生存率吸引了大家的高度关注。DCD供肝在移植前所经历的低灌注以及热缺血损伤是影响肝移植预后的主要因素。DCD供体的死亡诊断标准是基于患者心肺功能的不可逆丧失,在这一过程中,机会不可避免的会经历一段缺氧和低血压的时期导致肝脏灌注减低,而肝脏作为机体最大的代谢器官,本身对缺氧和低血压十分敏感,极容易受到缺氧损伤。尽管血管活性药物以及呼吸机的使用能在一定程度上改善DCD供体的缺氧和低血压情况,然而肝脏内微循环障碍甚至衰竭并无法得到有效的逆转,而肝窦作为半开放的管腔极易受到缺血性损伤。在撤除血管活性药和呼吸机等维持DCD供体生命体征的治疗后,供肝从身体取出前还会经历一段完全的热缺血时间,其长短会对供肝的组织活力和功能产生极大影响。因此研究DCD供肝低灌注后热缺血损伤机制是改善DCD肝移植预后的关键。然而,目前对热缺血损伤机制的研究并不明确。DCD肝移植预后差于DBD肝移植的现象并未发生在DCD肾移植中,这提示我们肝脏因缺氧和低血压引起的热缺血损伤机制不同于其他器官。传统观点认为,肝脏是机体最重要的代谢器官,而现在越来越多的研究表明,肝脏除了是一个重要的代谢器官外,还是一个以固有免疫为主体的免疫器官。NK, NKT细胞等固有免疫细胞占肝内总淋巴细胞的一半以上。因此,固有免疫对DCD供肝低灌注和热缺血损伤的免疫调控与应答是区别于DCD肾移植的重要因素。Toll样受体(toll-like receptor,TLRs)做为固有免疫最重要PRRs之一,不仅可以识别细菌、病毒等外源性配体,还能识别体内的各种危险信号,十分广泛的参与了肝脏的局部免疫应答与调控,并且在肝脏缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)中发挥着重要的作用。TLR1-9广泛表达于肝内各类细胞表面以及细胞内,其中,TLR3表达于肝实质细胞、胆管上皮细胞、Kupffer细胞、DC细胞以及肝内淋巴细胞中。研究结果表明,TLR4-/-、TLR9-/-可以显著减轻肝脏缺血再灌注损伤。而最新的研究显示,TLR3在介导肾脏IR损伤中也发挥了重要的作用。这进一步提示我们TLRs在肝脏局部固有免疫应答与调节中发挥着重要的作用,我们由此猜测以TLRs为主要受体的固有免疫很可能介导了DCD供肝热缺血损伤的发生。目前尚无模拟DCD供肝状态的稳定动物模型,我们通过门静脉结扎的方法建立小鼠肝脏持续低灌注模型,这在一定程度上能够模拟DCD供肝的低灌注状况,尤其是对马氏Ⅲ类供体而言。我们采用TLRs基因敲除小鼠建立低灌注模型后,通过肝功能和病理评估肝损伤情况,探究以TLRs为主要受体的固有免疫反应对小鼠低灌注后热缺血损伤的潜在作用,通过安捷伦小鼠表达谱芯片分析以及流式细胞术等方法研究固有免疫介导和调控热缺血损伤的潜在机制。通过对小鼠热缺血损伤机制的研究也能在一定程度上为明确临床DCD供肝热缺血损伤机制提供有意义的指导和借鉴。一、模拟心死亡器官捐献供肝状态的小鼠肝脏持续低灌注模型目的：建立稳定的小鼠肝脏持续低灌注模型,并在此基础上研究肝脏持续低灌注对小鼠肝脏热缺血再灌注损伤的影响。方法：建模选用6-8周龄C57BL/6小鼠,将门静脉缩窄至1ml注射器针头直径,门静脉缩窄后3d、7d、14d和21d行肝功能及肝脏组织病理学检测,选用稳定的模型小鼠行70%缺血再灌注手术,再灌注3h、24h、48h后行肝功能及肝脏组织病理学检测,对照组采用正常C57BL/6小鼠行缺血再灌注手术。结果：小鼠门静脉缩窄术后,术后ALT和AST均显著升高(F=68.9,p0.001),并在7d时达到高峰(ALT:60.8±6.2U/L vs 25.5±2.8 U/L,p0.001；AST:74.9±6.1 U/L vs 39.1±3.2 U/L,p0.001),同时HE染色显示7d时肝细胞损伤最重,并且有较多炎细胞浸润,在21d时,ALT基本恢复正常(p=0.12),而AST仍高于正常水平(p=0.03)；低灌注处理7d的小鼠进行缺血再灌注手术后,肝酶和组织病理学检查显示肝细胞损伤较对照组显著加重,肝酶在再灌注3h达到高峰(ALT:8217.0±1111.8 U/L vs 5597.4 ±1015.3 U/L,p=0.004；AST:8548.2±1155.4 U/L vs 5765.4±956.9 U/L,p=0.003),再灌注48h时,对照组小鼠ALT和AST均恢复正常,而经过低灌注处理的小鼠肝酶仍显著高于对照组(ALT:608.8±442.9 U/L vs 47.4±20.1 U/L,p=0.008；AST:861.8±442.8 U/L vs 70.8±68.3 U,L,p=0.008).结论：我们成功建立了稳定的小鼠肝脏持续低灌注模型,经持续低灌注处理后的肝脏对热缺血再灌注损伤的耐受能力显著降低,这在一定程度上能够模拟临床上DCD供肝的状况。二、小鼠TLR3-/-对DCD供肝热缺血损伤的影响及潜在机制研究目的：在小鼠肝脏持续低灌注模型基础上,进一步研究小鼠TLR3对肝脏持续低灌注后热缺血损伤的作用和机制。方法：实验组采用相同体重、周龄的TLR3-/-、TLR4-/-、TLR9-/-、MyD88-/-小鼠建立小鼠肝脏持续低灌注模型,对照组采用WT小鼠建立模型,通过肝功能及肝脏组织病理学检测比较各组小鼠肝脏低灌注后热缺血损伤程度：另选TLR_3-/-(实验组)和WT(对照组)小鼠建立稳定的肝脏持续低灌注模型后,对小鼠行70%缺血再灌注手术,再灌注3h、24h、48h后行肝功能及肝脏组织病理学检测,比较两组小鼠经持续低灌注处理后的肝脏对热缺血再灌注损伤的耐受能力；分离、提取经低灌注处理的WT小鼠肝脏淋巴细胞和低灌注处理后行缺血再灌注手术WT小鼠的外周血单核细胞,进行安捷伦小鼠表达谱分析；分离提取经低灌注处理的WT、TLR3-/-小鼠肝脏淋巴细胞,使用流式细胞术检测低灌注肝脏T、B淋巴细胞的变化情况；结果：在肝脏持续低灌注模型中,TLR4、TLR9、MyD88缺陷小鼠ALT和AST水平与WT小鼠相比无明显差异,而TLR3-/-小鼠ALT、AST水平显著低于WT小鼠(ALT:35.0±10.7 vs.68.0±8.8,p0.001；AST:39.9±9.4 vs.75.1±63,p0.001),HE染色显示TLR3-/-小鼠肝细胞损伤轻于WT小鼠,同时炎细胞浸润明显减少；经过低灌注处理的TLR3-/-小鼠肝脏同WT小鼠相比,肝缺血再灌注损伤明显减轻,TLR3-/-和WT小鼠肝酶在再灌注3h达到高峰(ALT:4519.6±1025.7 U/L vs.7634.4±742.U/L, p0.001；AST:4009.2±1201.3 U/L vs.7961.4±977.2U/L,p0.001),再灌注48小时TLR3-/-小鼠ALT和AST虽未恢复正常,但显著低于WT小鼠(ALT:129.4± 114.3U/L vs.669.4±201.8 U/L,p=0.001；AST:175.4±156.8 U/L vs.653.8±251.6 U/L,p=0.007)。HE染色显示,同WT小鼠相比,TLR3-/-小鼠肝细胞损伤明显减轻,特别是几乎无淋巴细胞浸润；表达谱芯片分析结果显示,低灌注肝脏中出现了B细胞特有表面分子CD19、CD20的表达以及B细胞活化因子Baff的升高,同时趋化因子CCL7、CCL2、CXCL4表达升高,作为危险内源性信号的HSPA4也出现表达,对经过低灌注处理WT小鼠行缺血再灌注手术后检测外周血单核细胞表达谱,发现在固有免疫通路下游信号(包括干扰素诱导基因、细胞因子)出现异常活化表现,特别是IP-10等趋化因子以及趋化因子受体出现爆发式升高；流式细胞术检测结果显示,经持续肝脏低灌注7d的WT小鼠肝脏中出现了大量B细胞侵润；而与之相反的,TLR3缺陷小鼠肝脏的B淋巴细胞表达明显降低。结论：TLR3-/-能显著减轻小鼠持续低灌注后热缺血损伤,增加低灌注肝脏对缺血再灌注损伤的耐受性。其机制可能在于,TLR3的缺陷阻断了通过MyD88非依赖途径的固有免疫信号传导,减轻B细胞的活化和浸润,同时趋化因子表达降低减轻了缺血再灌注时期粒细胞浸润所介导的炎症损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3
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本文编号：
2293142
