【摘要】：第一部分异丙酚对原代培养新生大鼠海马神经元的损伤作用目的:观察异丙酚不同浓度和不同作用时间对原代培养的海马神经元的损伤作用,倒置相差显微镜观察神经元形态,采用MTT法检测异丙酚对发育期海马神经元活力的影响;用流式细胞术测定不同浓度异丙酚作用24h对海马神经元凋亡率的影响;Hoechst33258核染色法观察不同浓度的异丙酚对发育期海马神经元细胞形态的影响。方法:用原代培养4d左右的海马神经元,分别加入不同浓度的异丙酚1μg/ml、10μg/ml/、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml或60μg/ml异丙酚处理海马神经元6、12、24、48h后,倒置相差显微镜观察神经元形态,并用MTT法测定OD值。每次实验设定DMSO溶剂对照组。细胞活力=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)。据MTT实验筛选结果,再在4~5d的海马神经元中加入20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的丙泊酚,继续培养24h后采用流式细胞术Anxexin V/PI法测定神经元凋亡率。然后再用同样的方法采用Hoechst33258核染色法验证不同浓度异丙酚对海马神经元凋亡的影响。结果:1 MTT法检测结果显示异丙酚对海马神经元活力的抑制是有时间和浓度依赖性的(P0.01)。高于或等于20μg/ml浓度的异丙酚在作用时间相同的情况下,随着浓度的升高,细胞活力显著下降(P0.01)。60μg/ml异丙酚对海马神经元作用时间超过12h后,随着时间的延长,细胞活力亦显著降低(P0.01)。2海马神经元经不同浓度的异丙酚处理不同时间后,可以观察到神经元数量逐渐减少,细胞体积变小,折光性变差,浓度升高到一定程度(60μg/ml)时,可以观察到神经突起断裂,甚至部分神经元胞体破裂成碎片。3流式细胞术Anxexin V/PI法检测细胞凋亡率的结果表明,20μg/ml异丙酚对凋亡率的影响与对照组无显著差异,40μg/ml、60μg/ml和80μg/ml浓度对凋亡率的影响与对照组比较有显著性差异(P0.05,P0.01,P0.01),且凋亡率随浓度增加而逐渐升高。4 Hoechst33258核染色法观察不同浓度的异丙酚对发育期海马神经元细胞形态的结果显示,染色最终结果与MTT、流式细胞术趋势类似。随着异丙酚浓度的增加,凋亡神经元数目随之增多,80μg/ml的异丙酚作用24h后,神经元数量明显减少,有部分细胞核裂解为碎块,出现凋亡小体。结论:异丙酚呈浓度及时间依赖性的抑制发育期海马神经元活力。高浓度异丙酚呈浓度依赖性导致发育期海马神经元凋亡率增加。高浓度的异丙酚处理神经元,对神经元形态和数量有明显影响。第二部分Rho GTP酶在异丙酚对原代培养新生大鼠海马神经元毒性中目的:检测不同浓度异丙酚对Rho GTPases家族的Rho A,ROCK1,Rac1和PAK1表达水平的影响;观察Rho激酶特异性抑制剂Y27632对异丙酚导致的发育期海马神经元损伤的影响。方法:将培养4d的海马神经元分为四组,每组加入不同浓度的异丙酚,异丙酚终浓度分别为0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml,将每组中溶剂DMSO的浓度均调整为0.04%。加入药物培养12h后Western blot法检测各组Rho A,ROCK1,Rac1和PAK1蛋白的表达水平;将原代培养4d的海马神经元分为四组:溶剂对照组(加入相同浓度的DMSO,C组),异丙酚组(终浓度为60μg/ml,P组),异丙酚+Y27632组(异丙酚终浓度为60μg/ml,Y27632终浓度为10μM,P+Y组),Y27632组(终浓度为10μM,Y组),加入药物后培养24h,采用MTT法测定各组海马神经元的存活率,流式细胞术Anxexin V/PI法检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组海马神经元cleaved-Caspase-3的表达验证流式细胞术的结果。结果:1 Western blot法检测不同浓度异丙酚对海马神经元Rho A,ROCK1,Rac1和PAK1表达水平的结果显示,异丙酚处理20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml组中Rho A表达水平呈浓度依赖性升高,且与对照组比较有显著性差异(P0.05,P0.01,P0.01);异丙酚处理20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml组中ROCK1表达水平亦呈浓度依赖性升高,且与对照组比较有显著性差异(P0.05,P0.01,P0.01);不同浓度异丙酚处理后,Rac1的表达水平虽然随异丙酚浓度升高而降低,但与对照组比较均无显著性差异;与对照组比较,PAK1的表达水平随异丙酚处理浓度的升高而显著降低(P0.01)。2 MTT法检测Y27632对异丙酚所致发育期海马神经元活力的影响结果显示,与对照组比较,异丙酚组神经元活力显著下降(P0.01),Y27632单独处理组神经元活力无统计学差异;与P组比较,Y27632与异丙酚共处理24h后神经元的活力显著升高(P0.01)。3 Anxexin V/PI双染法检测Y27632对异丙酚导致的发育期海马神经元凋亡的影响,结果显示对照组(C组)与Y27632单独处理组(Y组)仅有少量神经元凋亡,两组之间比较凋亡率无统计学差异,异丙酚组(P组)神经元凋亡率较对照组有显著增加(P0.01),Y27632可使异丙酚导致的神经元凋亡显著降低(P0.01)。4 Western blot法检测发育期海马神经元cleaved-Caspase-3的表达,结果显示,与对照组(C组)比较,Y27632单独处理组(Y组)cleaved-Caspase-3的表达量无统计学差异,异丙酚组(P组)神经元cleaved-Caspase-3的表达量比C组显著增加(P0.01),与P组比较,Y27632与异丙酚共处理组(P+Y组)神经元的cleaved-Caspase-3的表达量有所降低(P0.05),说明异丙酚处理可以导致神经元凋亡率升高,此结果与流式细胞术结果趋势一致。结论:异丙酚能够增加Rho A和ROCK1的表达水平,降低PAK1的表达水平。抑制Rho激酶通路(Rho/ROCK)的活性可以减轻异丙酚对发育期海马神经元的损伤作用。Rho激酶通路的激活可能是异丙酚造成发育期神经元损伤的机制之一。第三部分异丙酚对发育期SD幼鼠海马神经细胞凋亡和远期学习记忆功目的:用连续7d的腹腔异丙酚注射方式,对处于大脑快速发育期的7日龄SD乳鼠进行处理,观察海马神经细胞的凋亡情况及成年后大鼠学习记忆功能有无改变。方法:七日龄SD大鼠69只,随机分为三组,每组23只,异丙酚组(P组)腹腔注射异丙酚50mg/kg;溶剂对照组(S组)腹腔注射等容量脂肪乳5ml/kg;空白对照组(C组)腹腔注射等容量生理盐水,腹腔注射连续7d,每天1次,麻醉后将幼鼠放入恒温孵育箱中并持续低流量吸氧,麻醉过程中观察幼鼠皮肤颜色变化,翻正反射恢复后放回母鼠身边,与母鼠分离时间不超过5h,各组随机取5只测定血糖及血氧饱和度,随机取3只用尼氏染色(Nissl staining)观察神经元损伤情况,5只TUNEL法检测大鼠海马CA1、CA3及齿状回区神经细胞凋亡情况的影响,5只用caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3酶活性变化,各组剩余10只饲养至60d成年后用Morris水迷宫测试成年后大鼠学习记忆功能有无改变。结果:1各组大鼠血糖值和血氧饱和度均在正常范围内,无显著性差异(P0.05)。2 Nissl染色发现对照组C组和溶剂对照组S组各区均无明显差别,未见神经细胞缺失,海马神经细胞形态正常。与C组相比,P组幼鼠在海马CA1区可见部分神经细胞缺失,细胞形态亦欠完整,胞浆内尼氏体减少,神经元数量减少,P组CA3及齿状回区细胞形态偶可见细胞形态异常及着色减浅,但细胞缺失不明显。3 TUNEL法发现,与C组比较,S组各区神经细胞凋亡数量无显著差异,P组CA1区及CA3区的凋亡细胞数量较C组明显升高(P0.01,P0.05),P组齿状回区神经细胞凋亡数量与C组比较无统计学差异,说明异丙酚处理可以使大鼠海马CA1和CA3区神经细胞凋亡率升高。4 Caspase-3活性检测试剂盒检测发现,与空白组C组比较,异丙酚处理组P组caspase-3的活性显著升高(P0.01),而脂肪乳溶剂对照组S组与C组之间无显著性差异,各组总体趋势与TUNEL法检测结果一致。5在5d的训练期内,前3d各组大鼠逃逸潜伏期未见统计学差异。第4d和第5d,P组与对照组C组的逃逸潜伏期有统计学差异(P0.01)。溶剂对照组S组与C组相比在在5d的训练期内都无统计学差异。第6d空间探索实验中,P组与C组比较,其穿台次数明显减少(P0.01),S组与C组比较,穿台次数无统计学差异。结果表明异丙酚可以影响大鼠的学习记忆能力。结论:连续7d给予7日龄SD幼鼠腹腔注射异丙酚可致海马神经细胞损伤,凋亡增加,成年后学习记忆能力受损。第四部分盐酸法舒地尔对异丙酚引起的发育期大鼠海马神经细胞凋亡的保护作用及其机制研究目的:观察盐酸法舒地尔是否对异丙酚导致的海马神经细胞凋亡有无保护作用,以及p38MAPK信号通路在其中的作用,为临床防治异丙酚的发育期神经毒性提供实验依据。方法:健康七日龄SD大鼠72只,随机分为四组,每组18只,异丙酚组(P组)腹腔注射异丙酚50mg/kg;盐酸法舒地尔+异丙酚组(PF组)腹腔注射盐酸法舒地尔10mg/kg+异丙酚50mg/kg;盐酸法舒地尔组(F组)腹腔注射盐酸法舒地尔10mg/kg;空白对照组(C组)腹腔注射等量生理盐水。腹腔注射连续7d,每天1次,注药后待翻正反射消失,将幼鼠放入恒温孵育箱中并持续低流量吸氧,翻正反射恢复后放回母鼠身边,与母鼠分离时间不超过5h。各组随机选5只幼鼠检测血糖及血氧饱和度,TUNEL法各组随机选取5只检测幼鼠海马CA1区神经细胞凋亡情况,各组随机选3只采用Western blot检测p38MAPK,p-p38MAPK,Bcl-2及Cleaved-caspase-3蛋白表达的变化,各组剩余10只饲养至生后60d用Morris水迷宫测试SD幼鼠成年后的空间学习记忆能力。结果:1 TUNEL法检测各组海马CA1区神经细胞凋亡的结果显示,同C组相比,F组凋亡细胞凋亡细胞数量无统计学差异,P组的凋亡细胞数量较C组明显升高(P0.01),PF组凋亡细胞数量比P组显著减少(P0.01),说明异丙酚可使海马CA1区神经细胞凋亡增加,而盐酸法舒地尔对这种凋亡增加具有保护作用。2 Western blot法检测结果显示,p38MAPK表达水平:与C组比较,P组表达水平无统计学差异(P=0.105),F组表达水平明显降低(P0.05),与P组比较,PF组表达量无明显差异(P=0.150);p-p38MAPK表达水平:与C组相比,P组表达水平明显升高(P0.01),F组表达水平降低(P0.05),与P组比较,PF组表达水平明显降低;各组Bcl-2表达水平:与C组相比,P组表达水平明显降低(P0.01),F组表达水平升高(P0.05),与P组相比,PF组表达水平明显升高(P0.01);活化的caspase-3蛋白表达水平:与C组相比,P组表达明显升高(P0.01),F组表达无明显差异,与P组比较,PF组表达明显降低(P0.01),说明异丙酚可使海马神经细胞凋亡增加,而盐酸法舒地尔可使凋亡减少,此结果验证了TUNEL检测各组凋亡的结果。3在5d的训练期内,前3d各组大鼠逃逸潜伏期未见统计学差异,第4d和第5d,与C组相比,P组逃逸潜伏期都明显延长(P0.01),这与本论文第三部分结果一致,F组逃逸潜伏期与C组均无统计学差异,与P组相比,PF组逃逸潜伏期均明显缩短(P0.05);第6d的空间探索实验,P组与C组比较,其穿台次数明显减少,有统计学差异(P0.01),F组与C组比较,穿台次数无统计学差异,与P组比较,PF组穿台次数明显增多(P0.05)。结果说明盐酸法舒地尔对异丙酚造成的大鼠学习记忆损害具有保护作用。结论:盐酸法舒地尔可以对异丙酚导致的幼鼠海马神经细胞凋亡产生保护作用。异丙酚可以激活p38MAPK信号通路,此通路的抑制是盐酸法舒地尔对异丙酚发育期神经细胞损伤保护作用的机制之一。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R614
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