Cdc42调控长骨发育机制研究

发布时间：2018-11-25 08:41

【摘要】：人类疾病中有许多是与骨相关的,如骨质疏松、软骨发育不良、骨性关节炎等。因此,深入研究骨发育的分子机制对于疾病诊断、预防和治疗意义重大。脊椎动物的骨形成主要有两种形式：膜内成骨(Intramembranous ossification)和软骨内成骨(Endochondral ossification)。软骨内成骨过程是一个复杂的多步骤过程,起始于肢芽间充质干细胞的增殖和聚集,然后会先后经历软骨细胞分化、软骨细胞肥大化、肥大软骨细胞成熟凋亡、血管入侵及成骨分化步骤。Rho家族的小G蛋白(Rho small GTPase)成员包括Rac1、Cdc42和Rho A,可以在GTP形式与GDP形式间转换,从而作为信号传导途径的“分子开关”调节细胞周期、细胞运动、基因转录活性、信号传导等重要功能。近几年有报道指出Rac1可以调控经典Wnt信号促进成骨分化,基因敲除小鼠与体外细胞培养的结果显示Rac1与Cdc42调控软骨内成骨过程,但具体的分子机制尚不完全清楚。我们通过体外细胞学研究及条件性敲除小鼠研究揭示了Cdc42在软骨内成骨过程中具有重要作用,并对其调控机制进行了一定的探讨,对软骨内成骨的机制及Rho家族小G蛋白的功能进行了很好的补充。小鼠肢芽组织由顶外胚层嵴(Apical ectodermal ridge, AER)信号中心与极化活性区(Zone of polarizing activity, ZPA)两部分组成。首先我们通过观察顶端外胚层嵴敲除Cdc42 (Msx2Cre;Cdc42f/f)的转基因小鼠,发现Cdc42并不参与调控顶外胚层嵴的活性。间充质细胞敲除Cdc42 (PrxCre;Cdc42f/f)的小鼠呈现出四肢短粗、颅骨开放性缺失的表型,进一步的组织切片HE染色发现Cdc42敲除的转基因小鼠股骨中心有过度增生的肥大软骨细胞,不能出现正常的血管入侵。上述表型充分说明Cdc42参与软骨内成骨过程。为了明确小鼠骨发育异常的原因,首先我们取PrxCre;Cdc42f/f的小鼠股骨做成骨与软骨分化标记基因的原位杂交,结果显示成骨细胞及血管入侵的标记基因基本无异常。另外,在体外细胞学上我们分别检测了成骨分化标记基因的表达、成骨分化转录因子Runx2的荧光素酶报告基因活性,并进行了成骨分化诱导的茜素红染色明确矿物化结节形成能力；在整体动物上我们观察了成骨细胞特异性敲除Cdc42的转基因小鼠表型,结果均表明Cdc42基因敲除小鼠的骨骼异常是继发于软骨发育过程的,Cdc42并不能直接调控成骨细胞的分化,而是调控软骨分化。软骨分化过程起始于间充质细胞的增殖和聚集,而Sox9是软骨发生早期阶段的主要决定因子,对于间充质细胞的聚集是必须的。首先我们检测了Sox9的whole mount原位杂交,结果显示在E12.5天时Sox9应表达于尺、桡骨及跖骨形状的细胞聚集区及其软骨结构的部位,而缺失Cdc42的转基因小鼠中Sox9的表达弥散于整个肢芽结构。然后我们通过小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T1/2)的微团培养发现敲降Cdc42可以抑制BMP-2所诱导的细胞聚集,而持续激活Cdc42可以增强BMP-2的诱导作用。同时荧光定量PCR的结果显示敲降Cdc42后显著抑制细胞聚集的标记基因N-cadherin的表达。以上实验结果均说明Cdc42在间充质细胞聚集过程中扮演了重要的角色。为了进一步探讨Cdc42调控间充质细胞聚集的机制,我们在C3H10T1/2细胞上开展了一系列的研究。Western blot的结果显示敲降Cdc42或抑制Pakl均抑制BMP-2诱导的Smad1/5与p38的磷酸化水平；核质分离结果显示抑制p38或Pakl后抑制了Smad1/5的入核能力；免疫共沉淀的结果显示p38与Smad5存在相互结合。上述结果说明Cdc42调控间充质细胞聚集可能是通过Pak1/p38/Smad信号通路。为了验证此信号通路对细胞聚集的影响,我们再次利用C3H10T1/2细胞做微团培养,结果发现敲降Smad4或抑制p38的活性都会抑制BMP-2诱导的细胞聚集,同时我们发现敲降Cdc42引起的聚集受抑制表型可以通过添加p38的激动剂挽救。最后我们选取PrxCre;Cdc42f/f的小鼠E11.5天的肢芽做免疫组化和western blot,结果显示,与同窝仔比间充质细胞敲除Cdc42的小鼠肢芽中磷酸化的Smad与p38的水平有一定的下降。上述结果提示我们Cdc42调控间充质细胞聚集过程是通过BMP-2/Pak1/p38/Smad信号通路实现的。间充质细胞聚集后会向软骨细胞分化,然后发生肥大化。实时荧光定量PCR的结果显示,敲降Cdc42或抑制Pakl抑制TGF-β所诱导的软骨分化的标记基因Col2a1的表达；荧光素酶报告基因检测结果显示软骨分化的转录因子Sox9的荧光素酶报告基因活性同样受到了抑制。结果提示Cdc42同样参与软骨细胞早期分化过程。进一步的体外细胞学实验结果表明敲降Cdc42或抑制Pakl均对AKT1的活性及Sox9的磷酸化有一定的抑制作用,而且持续激活AKT1则能挽救敲降Cdc42导致的Sox9活性受抑制的结果。细胞核质分离的结果显示敲降Cdc42或Pakl显著降低了Sox9的入核能力。表明Cdc42调节软骨细胞早期分化是通过Pakl激活AKT1所支配的Sox9的转录实现的。同时我们检测了肥大软骨细胞的标记基因Col10的表达、肥大软骨细胞成熟的转录因子Runx2的转录活性等,均未发现Cdc42对其有影响。我们通过肥大软骨细胞缺失Cdc42 (Col10Cre;Cdc42f/f)的转基因小鼠骨骼制备及HE染色验证了Cdc42缺失不参与软骨细胞的肥大化及成熟过程。综上所述, Cdc42正向调控间充质细胞聚集过程, 并通过BMP-2/Cdc42/Pak1/p38/Smad信号通路实现；通过TGF-β/Cdc42/Pak1/AKT1/Sox9信号事件调控软骨细胞的早期分化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R68

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本文编号：2355481