人骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化中长链非编码RNA的初步研究

发布时间：2018-12-21 07:06

【摘要】：研究背景间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于中胚层的多潜能干细胞,其具有很强的自我更新和多项分化潜能。在给予适宜的体内或体外诱导环境下,其可分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等。间充质干细胞是骨与软骨组织工程研究常用的种子细胞,在再生医学研究中具有广阔的应用前景。骨髓来源的间充质干细胞因获取和培养简单方便,是目前使用最为广泛、研究最多的间充质干细胞。间充质干细胞的成骨、成软骨定向分化是干细胞研究的热点,目前其具体的定向分化机制仍不明了。长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。其占到非编码RNA的80%以上,但却是目前研究及了解最少的一类RNA。其不具有蛋白编码功能,但研究发现lncRNA在生长发育与分化过程中发挥重要作用。lncRNA具有复杂的生物学功能,参与机体诸多生物学行为,并与人类疾病的发生、发展和防治有密切的关系。然而关于lncRNA在人骨髓间充质干细胞成骨、成软骨定向分化过程中的作用尚无系统的报道和研究。该研究对于间充质干细胞定向分化过程中的IncRNAs进行了初步筛选,为后续的机制研究奠定了基础。目的1.对人骨髓间充质干细胞进行成骨及成软骨诱导分化,为筛选与定向分化有关的lncRNA提供细胞样本。2.利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微阵列芯片技术分别筛选人骨髓间充质干细胞成骨分化组与未分化组、成软骨分化组与未分化组之间差异表达的IncRNAs和mRNAs。3.利用生物信息学技术对差异表达的lncRNA和mRNA进行分析,筛选可能参与定向分化过程的lncRNA,预测其潜在的生物学功能。研究方法1.对人骨髓间充质干细胞进行细胞培养,对P3 MSCs分别进行成骨及成软骨诱导分化,分别设立实验组及对照组。在诱导分化后Day 14进行细胞染色及相关基因的检测进行诱导分化的验证。2.分别取3个成骨诱导分化、3个成软骨诱导分化和3个正常培养未分化Day 14的细胞样本作为芯片检测样品,提取细胞样本的总RNA。经质控合格后,利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微阵列芯片技术对定向分化组与对照组之间差异表达的lncRNAs和mRNAs进行筛选。3.通过Gene Ontology、Pathway分析以及构建lncRNA和mRNA的共表达CNC网络图等生物信息学分析,进一步分析差异表达的lncRNAs,筛选可能与定向分化有关的lncRNAs,初步探讨其生物学功能。4.采用qRT-PCR对芯片检测结果进行验证,并检测感兴趣的相关的lncRNAs在定向分化过程中的动态表达情况。研究结果1.我们对MSCs原代细胞进行培养,在传代培养至P3时分别进行成骨及成软骨诱导分化。我们采用ALP、茜素红染色及成骨相关基因ALP、Runx2及Col Ⅰ的检测进行成骨分化的鉴定。对于成软骨分化,阿利新蓝染色、免疫组化染色(Aggrecan、Sox-9、 Col Ⅱ)以及成软骨相关基因Aggrecan、Sox-9、Col Ⅱ的检测均表明了其成功诱导。2.通过对芯片检测结果进行初步分析整理,成骨分化组与未分化组间共有1206条lncRNAs差异表达(FC2.0或-2.0, P-value0.05),其中差异高表达的lncRNAs有687条,差异低表达的519条。另外,差异表达的mRNAs共2143条,其中上调表达的mRNA有957条,下调表达的mRNA有1186条。qRT-PCR对其表达情况进行验证,结果与芯片结果一致。3.成软骨分化组与未分化组间共有3638条lncRNAs差异表达(FC2.0或-2.0, P-value0.05),其中差异高表达2166条,差异低表达1472条。差异表达的mRNAs共5560条,其中上调1980条,下调3580条。qRT-PCR的验证结果与芯片结果一致。4.通过GO、Pathway分析及CNC网络图构建,对相关的lncRNAs进行了分析及生物学功能的预测。分别对lncRNA-H19和uc022axw.1在成骨分化过程中以及lncRNA-ZBED3-AS1和CTA-941F9.9在成软骨分化过程中的动态表达情况进行了观察,提示其可能参与MSCs的定向分化过程。结论1.本实验研究以人骨髓间充质干细胞为研究对象,对其进行了成骨及成软骨诱导分化,并进行了细胞染色和分化相关基因的检测进行了验证,为芯片检测提供了可靠的细胞样本。2.首次系统报告通过微阵列芯片筛选了人骨髓间充质干细胞成骨、成软骨分化与未分化之间间差异表达的lncRNAs和mRNAs,并通过GO、Pathway分析以及CNC网络图构建等生物信息学技术对差异表达的lncRNAs和mRNAs进行分析,初步探讨了lncRNA的生物学作用。3. lncRNAs在MSCs成骨及成软骨分化过程中存在差异表达,提示其可能在定向分化过程中的潜在作用。关于lncRNAs具体参与的调控机制需要后续的功能研究进一步探讨。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R68

【参考文献】

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1 Farbod Rastegar;Deana Shenaq;Eric R Wagner;Stephanie H Kim;Russell R Reid;Hue H Luu;Rex C Haydon;;Mesenchymal stem cells: Molecular characteristics and clinical applications[J];World Journal of Stem Cells;2010年04期

2 郭希民 ,王常勇 ,王永红 ,段翠密 ,赵强 ,孙大铭;人骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞定向分化的实验研究[J];中华口腔医学杂志;2003年01期

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本文编号：2388537