曲安奈德及普萘洛尔对瘢痕疙瘩成纤维细胞体外增殖的研究

发布时间：2018-12-29 10:05

【摘要】：研究背景瘢痕疙瘩(keloid,KD)是皮肤受损后形成的一种病理性瘢痕,临床上以疼痛、瘙痒等感觉异常为主要表现,呈进行性生长,并逐渐侵袭周围正常组织,单纯切除后复发率较高,并且新生瘢痕可能超过原有瘢痕,这与良性肿瘤有很大的相似之处[1]。其在组织学上,KD主要表现为成纤维细胞(Fibroblasts)的过度增生以及细胞外基质胶原过度聚集为特征,在皮肤受到创伤后,在正常情况下处于静止状态的成纤维细胞被激活并大量增殖。与此同时成纤维细胞合成大量的胶原并可以产生多种修复因子促进组织的愈合与修复。以致局部组织过度胶原纤维化,形成蟹足样外观,给患者造成一定的心理负担,发生在关节等处的KD还会在某种程度上导致患者的功能障碍[2]。目前,治疗瘢痕疙瘩的机制主要有减少和抑制瘢痕组织中成纤维细胞的增殖以及胶原的合成、抑制成纤维细胞的DNA合成促进其凋亡、增强胶原酶的活性促进胶原的降解等[3]。有关研究表明:瘢痕疙瘩的形成、发生以及发展过程中,一些细胞因子及其相关受体表达异常,例如:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)等。这些相关因子中TGF-β1是目前为止较为确切的因子,在创伤发生后,TGF-β1首先高水平表达于新生的血管中,进而激活周围的成纤维细胞并使其高表达TGF-β1,而TGF-β1在促进成纤维细胞增殖的同时,并能够刺激Ⅰ,Ⅲ胶原为主的多种细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白的分泌,使ECM过度沉积,从而形成瘢痕疙瘩。除此之外,瘢痕疙瘩成纤维细胞除了合成和分泌大量胶原蛋白外,在修复创伤的过程中,在缺氧微环境下,瘢痕疙瘩成纤维细胞可促进VEGF,AngⅠ等血管因子的表达增加,并诱导和促进血管内皮细胞形成血管的能力增强,这些促血管生长因子可能是造成瘢痕疙瘩呈侵袭性生长的一个重要原因[4],而VEGF是目前已知的血管生成因子中活性最强的,可以增强血管内细胞的活性并促进其分裂增殖,从而促进瘢痕疙瘩组织内部的血管密度增加,进而为瘢痕疙瘩的向外周正常组织的侵袭提供丰富血供。曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA),是目前临床上治疗瘢痕疙瘩的首选药物,主要是利用其强大的抑制炎症反应能力和抑制瘢痕组织成纤维细胞增殖的作用,可减轻非感染性和感染性炎症早期的组织充血、细胞反应及液体渗出等症状,并抑制组织愈合过程中肉芽组织的形成以及瘢痕过度生长[5]。普萘洛尔(Propranolol,P)作为治疗心血管疾病常用的β受体阻滞剂。2002年O’Callaghan CJ发现其具有抗纤维化和抑制胶原蛋白形成的效果,作用机制主要是通过竞争性抑制TGF-β1受体,进而抑制成纤维细胞的生物活性,减少胶原的分泌,从而达到抗纤维化的作用[6]。此外,普萘洛尔可能通过抑制ERK/MARK信号通路,从而使增殖期血管瘤VEGF的分泌减少。在血管瘤后期的治疗过程中,普萘洛尔可以通过下调MAPK信号通路,从而抑制VEGF和b FGF的表达,进而促进血管瘤的进一步消退[7][8]。而瘢痕疙瘩的形成离不开成纤维细胞的增殖以及胶原的沉积,亦离不开丰富的血供。2010年,DE Mesquita CJ提出了用普萘洛尔治疗瘢痕疙瘩的假说[9],目前关于普萘洛尔治疗瘢痕疙瘩的研究较少。此外,虽然曲安奈德治疗瘢痕疙瘩是目前临床上药物治疗瘢痕疙瘩的首选,但浓度仍然没有达成统一的标准。目的1.本实验拟以体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞为研究对象,探讨不同浓度的普萘洛尔及曲安奈德对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及VEGF的表达;2.筛选出普萘洛尔与曲安奈德抑制成纤维细胞增殖的有效药物浓度,比较两者药效之间的不同。3.为普萘洛尔在临床防治瘢痕疙瘩中的应用提供实验理论依据。方法1.标本来源为临床瘢痕疙瘩患者,并经郑州大学第一附属医院病理科证实为KD。2.采用两步胰蛋白酶消化法,提取瘢痕疙瘩成纤维细胞,并在体外原代贴壁培养,传代纯化。3.取传代培养至第三代,生长良好的瘢痕疙瘩成纤维细胞,利用免疫细胞组织化学技术,检测CD73,CD90和CD105间充质干细胞表面标记物,在瘢痕疙瘩成纤维细胞的表达,对成纤维细胞进行鉴定。4.用不同浓度(0mg/ml,0.05mg/ml,0.10mg/ml,0.20mg/ml,0.40mg/ml,0.80mg/ml,1.6mg/ml,3.2mg/ml,6.4mg/ml)的普萘洛尔及曲安奈德处理瘢痕疙瘩成纤维细胞24h,48h,72h;不加药培养基为阴性对照。5.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测普萘洛尔及曲安奈德对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和活力的影响。6.采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测其TGF-β1,VEGF,Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白的表达。采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计学分析。结果1.瘢痕疙瘩成纤维细胞的鉴定光镜下,观察瘢痕疙瘩成纤维细胞的形态,以长梭形为主,胞体外围有突起,细胞核呈椭圆形并位于胞体中间,呈平形状、放射状生长,结合成纤维细胞形态学特征、生长特性及成纤维细胞表面的CD73,CD90,CD105的表达,并联系临床诊断,确认所培养的细胞是瘢痕疙瘩成纤维细胞。2.曲安奈德及普萘洛尔对瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响2.1 MTT法显示:2.1.1曲安奈德在一定浓度下对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖有明显的抑制作用,并且抑制作用有明显的时间和浓度依赖性。在0.05mg/ml~6.4mg/ml范围内,曲安奈德浓度越高,对成纤维细胞的生长抑制率越高(P0.05);随着药物时间的延长,其抑制率越高(P0.05)。24h,48h,72h的IC50分别为5.2mg/ml,3.88mg/ml,1.91mg/ml,选用72h的IC50作为药物试验浓度。2.1.2普萘洛尔在一定浓度下对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力具有抑制作用,并且抑制作用有明显的浓度和时间依赖性。在0.05mg/ml~6.4mg/ml范围内,普萘洛尔浓度越高,对成纤维细胞的生长抑制率越高(P0.05);随着药物作用时间的延长,其抑制率越高(P0.05)。24h,48h,72h的IC50分别为6.2mg/ml,4.92mg/ml,2.84mg/ml,选用72h的IC50作为药物试验浓度。2.2 Western Blot法显示曲安奈德及普萘洛尔均对瘢痕疙瘩成纤维细胞的Ⅰ,Ⅲ胶原及TGF-β1,VEGF的表达均有明显抑制作用。结论1.曲安奈德及普萘洛尔对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞均有明确的抑制作用,其作用强弱有所不同,整体来看,曲安奈德对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用大于普萘洛尔,两者之间的差异有统计学意义(P0.05)。2.曲安奈德及普萘洛尔均可抑制TGF-β1,VEGF表达,Ⅰ及Ⅲ型胶原的分泌,除了VEGF之外,曲安奈德对其他三者的抑制作用更加明显。两种药物之间的差异有统计学意义(P0.05)。3.曲安奈德及普萘洛尔对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制作用有时间及浓度依赖性。4.曲安奈德与普萘洛尔相比,对成纤维细胞的抑制更强,所以推测曲安奈德除了能抑制TGF-β1,VEGF表达,Ⅰ及Ⅲ型胶原的分泌之外,还可能存在着其他抑制成纤维细胞作用的途径。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R622

【参考文献】