供体来源ImDex联合供体抗原特异性Treg保护大鼠肝脏移植物的研究

发布时间：2019-01-18 11:06

【摘要】：【背景】肝脏移植是根治终末期肝病唯一有效手段,移植术后患者将面临免疫排斥导致的移植物失功能和免疫抑制剂终生使用带来高感染率、高肿瘤发生和复发率、高昂的经济负担等问题。如何减少和避免免疫抑制剂的应用,是肝脏移植研究领域的重要方向[1]。免疫调节细胞的细胞学治疗使其成为可能[2]。而目前公认的具有免疫调控能力的细胞为im DC和Treg。当前认为im DC和Treg在调控免疫中相互促进,协同作用。已知im DC促进Treg分化并且扩增Treg,而Treg能帮助im DC保持其未分化状态。不过总体来说im DC处于中心地位[3]。但是其受限于保存时间短,体内易被激活成熟,因而治疗性研究受到限制。可喜的是,研究发现DC分泌的膜性微囊—Exosome,表面富含免疫相关分子,并内含DC所提呈的外源性抗原,甚至具有一定量的遗传物质,且性质稳定,低温下可长久保存[4]。为解决上述DC治疗性研究受限制及诱导耐受效果弱等问题,文献报道和前期研究都利用了供体im DC来源的Exosome(im Dex)探究其保护移植物的作用。结果表明供体来源im Dex可一定程度上延长鼠类心脏和小肠移植物的存活时间,且该保护效果与体内Treg比例有密切关系[5,6]。另外如需诱导出理想的耐受状态还需联合小剂量免疫抑制药物才可行。我们猜想,与im DC相似,im Dex在体内可能也是通过扩增Treg数量和增强其功能来发挥免疫调节。【目的】为了进一步减少免疫抑制药物的使用,并且验证我们的猜想。我们构建了近交系大鼠原位肝脏移植模型,在体内外试验中联用供体来源im Dex和抗原特异性Treg,观察二者联用的免疫调节效果,探究im Dex与Treg之间的作用关系。【方法】以BN/F344大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,建立大鼠原位肝脏移植模型。利用超高速梯度离心法获得供体im Dex。电子显微镜和流式细胞术对im Dex进行形态学和分子表型鉴定。对移植受体行不同剂量im Dex处理,再进行生存分析探究其对肝脏移植物的保护作用,并探索该作用与剂量之间的关系。利用两步免疫磁珠分选技术分选受体脾脏来源CD4+CD25+T细胞,而后与供体抗原提呈细胞共培养,获得供体抗原预刺激的Treg。流式鉴定其功能分子的变化,体外实验鉴定其免疫抑制效果。不同来源和不同特异性的Treg用于移植受体,验证抗原特异性对于Treg在移植免疫中的重要性。进一步体内实验中联合im Dex和Treg,应用生存分析,组织形态学和混合淋巴细胞培养技术观察两者联用对移植物可能的保护作用和受体体内免疫状态的变化。体外实验探究im Dex对Treg的作用,体内实验中,用CFSE标记Treg联合im Dex输注受体,观察Treg的增殖与im Dex之间的关系,验证体外结论。【结果】1)以超高速梯度离心法分离出较好保持了im DC表型的im Dex,其最佳作用剂量为20μg。2)具有供体抗原特异性Treg对移植物的保护作用显著高于单纯磁珠分选后的自然Treg(P0.05)。3)Im Dex和Treg两者联用组生存时间长于对照组(P0.01),联用组受体移植物10th天和40th天免疫排斥反应轻微,体内T细胞增殖活性及其细胞因子分泌均减低,外源性输注的Treg体内出现显著增殖,并且在受体移植物、脾脏、淋巴结中均有分布。4)进一步体外实验中发现imDex可以扩增Treg,5th天imDex高剂量组Treg增殖比例更高,但是7th后不同剂量im Dex处理Treg增殖效果相似,这提示im Dex的体内应用可能不需要过高剂量,这与前述的体内实验的结果相符。5)对体内Treg的检测表明,im Dex联合处理组Treg增殖显著高于单纯的外源性Treg处理组,验证了体外的实验结果。【结论】供体来源im Dex可以保护大鼠移植肝脏,本研究的分离和冻存方法稳定可靠。im Dex的应用一定程度上解决了im DC体外难以长期保存的难题;我们发现联合Treg细胞后可以实现稳定的移植免疫耐受状态。有望为临床提供新的治疗思路。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3

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