胆碱能抗炎通路介导右美托咪定对肾缺血再灌注损伤的保护作用

发布时间：2019-07-10 20:00

【摘要】：背景和目的:炎症反应在肾缺血再灌注(renal ischemia/reperfusion,r I/R)导致的急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的病理生理过程中,发挥着至关重要的作用。胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway CAP)激活,即中枢神经系统通过迷走神经及其烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,n ACh Rs)来调控局部和系统性炎症反应以维持机体内稳态。应用药物或迷走神经电刺激均能够抑制过度增强的炎症反应,从而对肾缺血再灌注损伤起到一定的预防和保护作用。右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是一种新型的的高选择性α2肾上腺素受体(α2 adrenergic receptor,α2AR)激动剂,目前作为一种麻醉辅助药物已广泛应用于临床麻醉、重症监护等,在发挥镇静、镇痛、抗焦虑、阻滞交感等作用的同时,还具有强力的抗炎和潜在的器官保护作用。我们前期的研究也已经证实,Dex在双侧肾缺血再灌注所致的急性肾损伤以及由此导致的远端肺损伤的小鼠模型中,具有明确的器官保护作用。在本研究中,我们发现给予Dex可以明显增强迷走神经活性,降低血清儿茶酚胺(catecholamine,CA)水平并增加乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)水平,同时降低血清炎症介质水平,减少肾脏细胞凋亡和肾组织病理变化,提供明确的肾保护作用。而在给予了α2AR拮抗剂阿替美唑(atipamezole,Atip)后再应用Dex,其抗炎作用消失,说明Dex的抗炎效应是通过α2AR的活化从而激活CAP来实现的。同样地,持续电刺激迷走神经(vagus nerve stimulation,VNS)也能发挥类似的抗炎效应,但在切断迷走神经后再给予Dex其抗炎作用消失。通过本研究拟证实,Dex发挥其抗炎效应依赖于α2AR的活化及迷走神经的完整性,它可以通过CAP的激活从而减轻r I/R所致的急性肾损伤而发挥肾保护作用。方法:1.迷走神经放电频率采集与分析1.1分离小鼠右侧颈部迷走神经,将其置于铂金电极头挂钩上,利用BL-420F信息采集和分析系统采集分析其放电频率1.2持续记录迷走神经放电在单独给予Dex或r I/R期间的变化1.3检测给予Dex后r I/R期间迷走神经放电的变化情况1.4检测给予阿替美唑后再给予Dex其迷走神经放电在r I/R期间的变化情况2.血清ACh和CA检测分析2.1小鼠ELISA ACh和CA试剂盒检测小鼠血清ACh和CA水平2.2分别对不同处理组的小鼠血清ACh和CA水平进行检测分析3.血清炎症介质检测3.1 Aimplex?Mouse Inflammation 8-Plex assay kits检测血清炎症介质水平3.2流式细胞术检测样本中抗原抗体复合物,FCAP Array 3.0分析其中各炎症介质水平4.肾脏损伤组织学观察及病理学评分4.1 HE染色切片镜下观察并采集图像4.2盲法评估组织病理学评分5.肾小管上皮细胞凋亡检测(TUNEL法)5.1 In Situ Cell Death Detection Kit,POD检测肾小管上皮细胞凋亡情况5.2随机采集10个视野/片,利用Image J软件统计凋亡细胞数/细胞总数,计算阳性率结果:1.Dex和r I/R均能显著增加小鼠颈部迷走神经放电频率,给予阿替美唑可导致Dex的该效应消失但对r I/R无明显影响。2.肾缺血再灌注对血清ACh和CA水平无明显影响,但给予Dex或VNS可显著增加血清ACh水平并降低CA水平,且不受切脾与否的影响。而给予阿替美唑和迷走神经切断后再给予Dex可导致其ACh水平下降。3.肾缺血再灌注可导致血清IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-10,VEGF,s ICAM-1和s P-selectin等因子水平显著升高,给予Dex或VNS可显著降低上述炎症因子水平,但对s VCAM-1无明显影响。切脾或给予阿替美唑,或者迷走神经切断均可导致Dex的抗炎效应消失。4.肾组织切片HE染色可观察到r I/R导致广泛急性肾小管扩张,肾小管上皮细胞扁平,核碎裂致未着色,组织病理学评分高。给予Dex或VNS可明显改善肾脏的病理改变并降低组织病理学评分,而切脾、迷走神经切断或给予阿替美唑,均可导致Dex对肾脏组织的保护效应消失。5.肾I/R可明显增加TUNEL染色凋亡阳性细胞数,并且通过定量分析,r I/R组阳性细胞率明显高于对照组,而给予Dex或VNS可显著降低凋亡细胞数。同样地,给予迷走神经切断或阿替美唑,均可导致Dex细胞保护效应消失,而切脾甚至加剧细胞凋亡。结论:1.Dex可直接增强迷走神经放电频率,从而增加血清ACh水平并降低CA水平。2.Dex可通过激活CAP降低r I/RI引起的血清炎症介质水平,从而提供肾保护效应。3.Dex的抗炎作用有赖于迷走神经环路的完整性。
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图片说明： 13：颈部正中切口；B：显露颈部解剖；C：分离并剪断胸乳突肌；D：显露颈部血管及迷走神：钝性分离神经；F：游离神经挂线备用；G：将神经置于挂钩；H：显露肾及肾蒂；I：夹闭图 1. C57BL／6J 小鼠颈部迷走神经放电频率采集及肾缺血再灌注模型制备2.1.1.3.2 小鼠血清及双侧肾脏标本收集（1）小鼠经水合氯醛麻醉后，固定于小动物显微镜手术台上并消毒胸腹部皮巾，罗哌卡因腹部皮下浸润麻醉。
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图片说明： ；B：I/R；C：Dex+I/R；D：Atip+Dex+I/R。图中 T 代表每 5min 一个时电频率，红色标记（D）代表给予 Dex；（I）代表缺血开始即刻；（R）代代表给予 Atip；* P<0.05 vs T2美托咪定对 C57BL/6J 小鼠颈部迷走神经放电频率的影响（各组 n=6-8，论胆碱能抗炎通路的研究当中，对迷走神经放电频率的检测往往后再检测其近心端（传入纤维）或者是远心端（传出纤维）的病理情况下不同的干预措施对胆碱能抗炎通路的激活的影响[20电刺激也是采用该方法，，切断迷走神经后再刺激近心端（传出模型的影响，这种方法可以分别明确迷走神经放电传入和传出
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R614

【参考文献】

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1 马剑波;黎娟娟;鲁开智;顾健腾;;小鼠颈部迷走神经放电采集方法在肾缺血再灌注实验中的运用[J];第三军医大学学报;2017年03期

本文编号：2512852