标准化激活态雪旺细胞修复脊髓损伤的临床前期研究

发布时间：2019-08-14 09:56

【摘要】：【目的】本研究旨在获取非人灵长类动物雪旺细胞高效激活方法、高表达营养因子的关键技术,制备出标准化非人灵长类动物脊髓损伤的模型,进而移植激活态的雪旺细胞修复灵长类动物损伤的脊髓,通过行为学评分,感觉诱发电位及运动诱发电位检测、组织学等观察其疗效,建立疗效评价平台,确定激活态雪旺细胞移植修复脊髓损伤的移植时间与移植浓度,从而规范化细胞移植修复脊髓损伤的评价标准,为临床激活态雪旺细胞移植治疗脊髓损伤提供参考指标和依据。【方法】1.雪旺细胞原代培养前7天结扎食蟹猴双下肢腓肠神经,采用胰酶和胶原酶两种传代纯化雪旺细胞,体外培养5天后采用S100免疫荧光染色方法鉴定雪旺细胞,DAPI染色标记细胞核,检测雪旺细胞纯度。2.分离纯化培养雪旺细胞,加入重组白介素-11(IL-11)分别采用RT-qPCR和Western boltting检测雪旺细胞髓鞘蛋白的表达,进一步检测IL-11调控髓鞘蛋白表达的相关情况。3.采用SS-II型大动物脊髓打机器(打击头直径5mm,打击冲量50g×50mm)制作非人灵长类动物脊髓损伤模型。模型制作完成后,采用基本行为学评分,笼内攀爬实验,改良Tarlov评分等行为学评分系统和体感诱发电位、运动诱发电位神经评分系统检测双下肢功能情况,确定脊髓损伤模型的稳定性。4.食蟹猴脊髓损伤后7天,在损伤部位多点微量注射激活态雪旺细胞,每点微量注射10μl,共计30μl,细胞浓度:2-3×105/μl,纯度95%,采用体感诱发电位、运动诱发电位及改良Tarlov评分等行为学评分方法检测双下肢功能,并通过HE染色方法和免疫组织化学染色观察组织学变化。【结果】1.经过两轮差速消化后,低浓度Ⅱ型胶原酶消化组雪旺细胞纯度为(96.1±1.68)%;对照组雪旺细胞纯度为(80.1±4.77)%,两组之间存在显著性差异,P0.01。2.白介素-11可以显著提高雪旺细胞中周围神经髓鞘蛋白22的表达水平,而对雪旺细胞中髓鞘碱性蛋白和髓鞘蛋白零的表达水平则没无明显影响,该生理作用可被JAK特异性抑制剂AG490所抑制。并且在经过IL-11处理的SCs细胞中可以观察到pJAK2(Y1007+Y1008)和pSTAT3(Y705)含量明显高于对照组且伴随着SCs中gp130表达的上调。3.脊髓损伤组食蟹猴双下肢体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期延迟,波幅降低,行为学评价显示脊髓损伤组较假手术组双下肢运动能力明显下降。4.在脊髓脊髓磋伤后第7天,在损伤部位多点微量注射激活态雪旺细胞,每点微量注射10μl,共计30μl,细胞浓度:2-3×105/μl,移植组HE染色显示空洞明显小于损伤组,GFAP染色显示胶质瘢痕面积小于损伤组(P0.05),NF200染色显示轴突生长大于损伤组(p0.05),行为学评分示移植组下肢功能恢复情况较损伤组有明显的好转。【结论】1.确定了雪旺细胞的自体来源,利用较少的神经组织在短时间内获得大量高纯度雪旺细胞。并且该培养方法未使用毛喉素等促进有丝分裂剂和阿糖胞苷等抑制成纤维细胞生长的物质,符合临床应用的要求,为自体雪旺细胞移植在临床的应用奠定了基础。2.IL-11可通过调剂gp130/JAK2/STAT3信号通路以促进雪旺细胞中周围神经髓鞘蛋白22的表达,从而在体外能更好的激活雪旺细胞。3.体感诱发电位和运动诱发点位作为一种定量、客观的脊髓电生理检测技术具有准确性好,灵敏度高的特点,可作为非人灵长类动物肢体功能评价的依据。行为学评分作为一种经典的评价方法,具有方便易行和经济实用的优点。本研究将脊髓损伤模型与电生理检测和行为学评分相结合,确保了模型制作的一致性,精确性,可重复性和经济实用性原则。4.在食蟹猴脊髓挫伤后第7天,在损伤部位多点微量注射激活态雪旺细胞,每点微量注射10μl,共计30μl,细胞浓度:2-3×105/μl,该移植途径以及移植剂量可为临床治疗脊髓损伤提供一定的指导意义,从而使细胞治疗脊髓损伤更具安全化,有效化,标准化。
【图文】：

原代培养,成纤维细胞,黑色,箭头

代培养48h后，镜下可见细胞贴壁良好，其中混有较多成纤维细头）（40x）细胞的纯度鉴定显微镜下观察，每组实验细胞在600×高倍镜下随机选取5个视呈绿色的为S100阳性细胞，可鉴定为雪旺细胞。经DAPI染色色，为细胞质与细胞核合成(图2)所示，仅有细胞核染色的细经过计算，两次纯化后低浓度Ⅱ型胶原酶消化组SCs纯度为（低浓度胰蛋白酶消化组SCs纯度为（80.1±4.77）%。经独立样本在显著性差异，P<0.01（SPSS 22.0）。

照片,免疫荧光染色

论文一．非人灵长类动物高纯度雪旺细胞原代培养方法12图2. 经过2次纯化后SCs免疫荧光染色。绿色荧光为S100，，代表SCs，仅有细胞核染色的细胞为成纤维细胞； DAPI染细胞核，（1）A、B、C为0.05%胰酶提纯的SCs照片，D、E、F为0.05%Ⅱ型胶原酶提纯的SCs照片；（2）图A为图B、C合并，图D为图E、F合并。（3）由图可见，经过低浓度Ⅱ型胶原酶提纯的SCs纯度明显高于低浓度胰蛋白酶提纯的SCs（600×）1.2.3. 雪旺细胞的增殖能力为了评估雪旺细胞的增殖能力，取经过2次纯化后的SCs接种在24孔板中
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R651.2

【参考文献】