同轴静电纺PLLA微阵列膜（MTAS）构建复合神经导管修复周围神经缺损的研究

发布时间：2019-10-23 06:01

【摘要】：目的:探讨同轴静电纺技术制备的新型PLLA微阵列膜(microtube array sheet,MTAS)的神经毒性及神经组织相容性,检测MTAS表面规则有序的沟槽结构对于体外培养的雪旺细胞(Schwann cells,SCs)及神经突起的导向性,并使用MTAS构建复合神经导管,从形态学、功能学、行为学评价其修复周围神经缺损的效果。方法:根据ISO10993-5材料毒性国际标准检测方法,制备PLLA-MTAS材料的孵育液,并用其培养原代SCs,观察细胞生长状态,MTT法检测细胞活力,Annexin V-PI双标检测细胞凋亡,之后采用Brd-U检测细胞增殖,Transwell法观察细胞迁移,Realtime-PCR检测SCs重要的神经营养因子NGF、GDNF、NT4、BDNF、CNTF的表达,评价MTAS的神经细胞毒性及神经组织相容性;并将SCs和神经元分别与MTAS共培养,激光共聚焦显微镜及电子扫描显微镜观察SCs的形态、排布以及神经突起的延伸状态;将MTAS衬于中空神经导管内壁,构建复合神经导管(Conduit+MTAS),以中空神经导管(Conduit)作为对照,修复大鼠坐骨神经10mm缺损,术后8w通过HE染色、免疫荧光、甲苯胺蓝染色、电镜、神经电生理、足迹步态以及热痛觉分析等方法,从形态到行为、功能,检测复合神经导管修复神经缺损的效果;并在此导管基础上,将原代SCs作为支持细胞种植于MTAS上,进一步构建生物型复合神经导管(Conduit+MTAS+SCs),修复大鼠坐骨神经缺损,术后8w检测生物型复合神经导管修复神经缺损的效果。结果:1.MTAS由多个直径约为50μm的电纺纤维管有序的平行排列构成,两个相邻的纤维管形成了规则的“V”形沟槽结构,沟槽的平均深度为8μm,宽度为20μm。浸于37℃PBS孵育28d后,材料表面的沟槽结构依旧规则有序,且表面沟槽的宽度无明显变化(p0.05)。使用MTAS预处理培养基培养原代SCs后,细胞形态、活力及凋亡情况均未发生明显变化(p0.05);SCs的增殖、迁移以及重要营养因子NGF、GDNF、NT4、BDNF、CNTF的表达等神经再生过程中的关键生物学效应亦未受抑制(p0.05)。MTAS材料稳定性佳,对于神经细胞无毒性作用,具有良好的神经组织相容性。2.SCs与MTAS共培养结果显示,SCs种植于MTAS上之后,多个SCs细胞首尾相连,沿材料表面的“V”型沟槽有序的排列,其长轴与电纺纤维管长轴的排布一致。将背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)感觉神经元与脊髓前角运动神经元细胞与MTAS共培养后,神经突起也改变了其在普通培养皿上随机生长的状态,突起聚集成束,沿MTAS表面沟槽有序生长延伸。MTAS材料的表面形貌可以引导体外培养的SCs的有序排布以及神经突起的定向延伸,具有良好的神经源性细胞导向性。3.将MTAS衬于SF/P(LLA-CL)中空神经导管内,构建复合神经导管(Conduit+MTAS),以中空神经导管(Conduit)作为对照,修复大鼠坐骨神经10mm缺损。结果显示,两种导管均可促进坐骨神经再生。神经导管移植8W后,免疫荧光检测导管远端的神经再生情况,长入导管远端的神经纤维的面积及神经纤维数量Conduit+MTAS组均大于Conduit组(p0.05);电镜结果显示:Conduit+MTAS组神经导管中段再生有髓神经纤维的直径显著大于Conduit组(p0.05),且Conduit+MTAS组再生神经纤维较规则,接近正圆,离心率为0.56±0.02,与正常神经(离心率为0.59±0.01)形态类似,而Conduit组的髓鞘神经纤维形态呈现不规则形及长条形,离心率达0.83±0.02,二者存在统计学差异(p0.05);高倍电镜结果显示再生神经的超微结构,观察再生神经突起的微管、微丝及周围的胶原纤维:Conduit+MTAS组呈规则的点状分布,而Conduit组则呈现点状和短线状交错分布的状态;计算腓肠肌恢复率及单个肌细胞面积,结果显示Conduit组肌肉萎缩状况明显较Conduit+MTAS组严重(p0.05);另外Conduit+MTAS组与Conduit组均有再生神经纤维长入腓肠肌,且再生的神经终末纤维与肌肉建立联系,形成了运动终板,单位面积运动终板计数Conduit+MTAS组优于Conduit组(p0.05);两组足底皮肤也均有再生神经纤维长入,有部分再生神经纤维从皮肤基底层长入表皮,再生神经的密度Conduit+MTAS组优于Conduit组;神经电生理结果显示:Conduit+MTAS组的CMAP峰值也显著高于Conduit组的(p0.05);以热痛阈值测量和坐骨神经指数的行为学实验分别检测大鼠感觉及运动功能恢复状况,结果显示:两组大鼠的感觉功能无显著差异(p0.05);Conduit+MTAS组大鼠运动功能恢复优于Conduit组(p0.05)。综上结果显示:MTAS材料具有良好的神经细胞导向性,可以引导再生过程中神经纤维的有序延伸,加快再生神经对靶器官的再支配,促进神经缺损损伤后的功能恢复。4.以复合神经导管(Conduit+MTAS)为基础,在MTAS上种植支持细胞-原代SCs,构建生物型复合神经导管(Conduit+MTAS+SCs)。比较两组再生有髓神经纤维的密度、直径、髓鞘厚度、G值,皮肤、肌肉神经的再支配程度、腓肠肌湿重、单个肌细胞面积及CMAP峰值;并进行热痛阈值和坐骨神经指数的测量,结果显示:除再生有髓神经纤维的直径及热痛阈值二组无显著性差异外,其余各测量指标Conduit+MTAS+SCs组均显著优于Conduit+MTAS组(p0.05)。以复合神经导管(Conduit+MTAS)为基础构建的具有支持细胞-SCs的生物型复合神经导管(Conduit+MTAS+SCs)修复周围神经缺损,可以进一步提高神经再生的效率。结论:由多个PLLA电纺纤维管平行排布构成的新型微阵列膜MTAS材料,具有规则的“V”型沟槽表面结构。本研究体内、体外实验相结合,首次证明此材料稳定性佳,无神经毒性,具有良好的神经组织相容性,其表面特殊的形貌修饰可以促进体外培养的SCs有序排布及神经突起的定向延伸,具有良好的神经源性细胞导向性;以MTAS材料构建复合神经导管,修复周围神经缺损,有利于神经再生及感觉、运动功能恢复,其效果显著优于中空神经导管组;将SCs作为支持细胞,修饰MTAS构建的复合神经导管,可以进一步提高神经再生的效率。本研究显示:MTAS是一种有潜力的神经组织工程材料,其特有的表面形貌为神经组织工程的材料修饰提供了新的方法和思路,MTAS可以构建复合神经导管,修复周围神经缺损,促进神经再生。本研究还为以MTAS为基础,进一步构建具有支持细胞的生物型复合神经导管提供了实验依据和理论基础。
【图文】：

图 1.同轴静电纺丝技术模式图Fig 1. Model diagram of Coaxial electrospinning technology层溶液和壳层溶液分别置于两个推进容器中， 在复合毛细喷头端口处汇集并形成芯-壳结复合液滴， 复合液滴在外加高压电场作用下，形成芯-壳结构的喷射细流，并在电场中运动材料本身表面张力、静电排斥力和库仑力的共同作用下，溶剂蒸发、材料固化，最终形成径很小的芯-壳结构纤维。同轴静电纺丝技术制备的组织工程材料优点如下：1.通过选择适当的芯层、壳合物材料，调整加工条件，即可以获得降解速率可控、材料厚度、结构等机械优越和力学性能最佳的纤维材料；2.静电纺纤维具有较高的孔隙率，有利于氧营养物质的交换和代谢物的排泄，比表面积（每克物质中所有颗粒总外表面积）大，有利于细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及 ECM 的分泌，为细胞的生供了良好的微环境；3.采用静电纺丝法制备的聚合物材料由纳米或亚微米级的纤维构成，与天然ECM中纤维的尺寸非常接近，这种类似ECM的特殊物理信号有利于细胞的粘附、迁移、增殖、分化； 4.另外，，通过对材料表面的物理化学

图 2.Realtime PCR 程序设置Fig 2. Reaction conditions of Realtime PCRf.1h 后收取反应结果，ΔΔCt 法分析实验结果。1.4 统计方法实验获得数据采用 GraphPad Prism Version 6.0c 软件进行整理和统计学分析。计量数据以平均值±标准差的形式表示，采用 Student's t-test 分析其统计学意义。统计检验得到的概率 p<0.05 为具有统计学意义。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.3

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