【摘要】：目的：在椎间盘退行性病变过程中,椎间盘内微环境中IL-1p表达的升高被认为是其重要的致病因素,而间充质干细胞治疗椎间盘退行性病变也被认为是具有巨大潜力的治疗策略。在众多实验中间充质干细胞都表现出良好的髓核细胞分化特性,以及体外实验中良好的恢复椎间盘高度的能力,本实验将从体外评价骨髓间充质干细胞(BMSCs)对白介素1p(IL-1β)干预后的髓核(NP)细胞保护修复能力。方法：1.实验细胞的分离、培养和鉴定以及实验分组。一型胶原,二型胶原的细胞免疫组化鉴定。取三代BMSCs通过流式细胞仪进行CD29、CD31、CD45、CD90位点鉴定细胞纯度。实验共分为三组：1.对照组：在无血清培养基条件下24 h后更换为含有完全培养基24h。2.炎性干预组(A组)：在无血清培养基条件下加入IL-1β(20ng/ml)干预24h后更换为含有完全培养基24h。3.共培养组(B组)：在无血清培养基条件下加入IL-1β(20ng/ml)干预24h后,更换含有完全培养基同时置入预先种入BMSCs细胞的transwell小室,共培养24h,三组实验都分为2个阶段,时间各24h。2.Realtime-PCR:BMSCs非接触共培养下炎性干预的NP细胞中基因的表达。采用Realtime-PCR检测三组获得NP细胞的ADAMTS-4、5、7,MMP-3、13,TIMP-1的基因相对表达量。3.细胞凋亡的检测：根据beyotime提供的Caspase-3活性检测试剂盒说明书,对于三组细胞CASPASE-3的活性进行检测。同时还对于三组细胞进行TUNEL染色,观察三组细胞的TUNEL染色的活性,进行比较。BMSCs非接触共培养下炎性干预的NP细胞凋亡比例变化。取各组NP细胞,使用Annexin V (PE)/PI流式试剂盒检测凋亡的变化。在流式检测中,加入直接共培养(C组),使用相同数量的GFP-BMSCs直接加入炎性因子损失的NP细胞中,观察四组髓核细胞凋亡数量的变化。4.细胞迁徙的检测：对于Ong/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml浓度的IL-1β干预髓核细胞24h,将transwell板由换成8-μm孔径的滤板,通过四组的比较,观察BMSCs对于炎性损伤的NP细胞的迁徙能力。5.线粒体染色现象观察：使用24孔提前铺片,使用IL-1β(20ng/ml)干预NP细胞24h之后,加入使用带有GFP荧光的BMSCs, GFP-BMSCs使用线粒体染料预染色,直接接触共培养24h后,将细胞玻片取出在共聚焦显微镜下观察。结果：1.NP细胞、BMSCs纯度鉴定。BMSCs传至第3代通过流式细胞仪通过CD29、 CD31、CD45、CD90位点鉴定细胞纯度,BMSCs的流式鉴定结果显示90%以上的BMSCs表现为CD29,CD90阳性,小于5%的BMSCs的CD31及CD45阳性,细胞纯度较好。髓核细胞免疫组化显示的二型胶原表达较好,符合NP细胞的胶原表达特点。2.Realtime-PCR结果,相比于对照组,A组中ADAMTS-4,ADAMTS-5, ADAMTS-7,MMP-13,MMP-3表达显著升高,五组数据之间差异有统计学意义(p0.05)。而相比A组,B组各项退变指标基因表达量显著降低,五组数据之间差异有统计学意义(p0.05)。3.细胞凋亡检测：三组细胞TUNEL染色显示炎性刺激组(A组)髓核细胞凋亡明显增加,BMSCs共培养组(B组)对于炎性因子导致的凋亡细胞的数量的增产生有效的抑制。在Caspase-3的检测中,A组比较对照组caspase-3活性升高明显,二者之间差异有统计学意义(p0.05),而相比于A组,B组中Caspase-3活性下降,二者之间差异有统计学意义(p0.05)。Annexin V (PE)/PI流式结果,与对照组相比,A组NP细胞在炎性因子刺激下凋亡增加明显,二者之间差异有统计学意义(p0.05)。经过BMSCs间接共同培养(B组)后,相比于A组,NP细胞凋亡下降明显,二者之间差异有统计学意义(p0.05)。Annexin V(PE)/PI流式结果中,直接共培养的结果(C组)和间接共培养组(B组)对凋亡都有抑制作用,但两者无统计学差异。4.BMSCs迁徙结果：通过考马斯亮蓝染色后BMSCs细胞数量的比较,可以发现,IL-1β浓度的不断升高,即随着炎性因子对于髓核细胞损伤的程度不断增加,BMSCs对于髓核细胞的迁徙能力不断增强。四组数据之间差异有统计学意义(p0.05)。5.线粒体一体化结果：从图可以看出GFP-BMSCs可以通过隧道纳米管,将线粒体传输进炎性损伤的NP细胞内,完成细胞之间的直接营养作用。结论：BMSCs可通过旁分泌的方式,有效降低炎性所致的NP细胞退变和凋亡的比例,说明BMSCs作为种子细胞在椎间盘退行性病变的治疗中,对于椎间盘炎性环境的“治疗”作用不可忽视。同时BMSCs可以炎性损伤的NP细胞进行迁移,说明BMSCs可以在椎间盘内炎性内环境严重的部位迁徙,发挥治疗作用,以及我们观察到在直接共培养的时候,BMSCs可以通过隧道纳米管,向损伤的NP细胞传输线粒体,通过本实验的设计可以一定程度上模拟体内干细胞治疗过程,为更准确的研究干细胞治疗机制提供条件。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R681.53
【共引文献】
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