新生期小鼠丙泊酚暴露对小脑及下丘脑的影响及机制研究

发布时间：2019-11-01 16:58

【摘要】：研究背景:动物研究发现几乎所有临床所用的静脉麻醉药在脑发育的关键时期可引起神经退行性变和异常的突触发生,进而导致后期行为表现改变和学习认知功能障碍。丙泊酚是一种新型静脉麻醉药,通过激活γ-氨基丁酸受体(Gamma Amino Acid Butyric Acid Receptor,GABAR)及抑制N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-Methyl-D Aspartate Receptor,NMDAR)而发挥作用,因起效快、苏醒迅速、且功能恢复完善而普遍应用于麻醉的诱导、维持以及ICU镇静。丙泊酚被发现同样存在神经毒性作用,新生期的丙泊酚暴露可抑制神经发生,引起神经元凋亡,并且有报道显示新生期的丙泊酚暴露导致后期的学习及记忆损害。麻醉药物在儿童这一特殊群体中可能存在的神经毒性作用已引起广泛的关注,进一步研究以深入了解其致病机制及制定预防措施迫在眉睫。小脑位于大脑半球后方,覆盖在脑桥及延髓之上,横跨在中脑延髓之间,是后脑的最大部分。小脑和大脑皮层一样具有典型的板层结构,由分子层(Molecular Layer,ML)、蒲肯野细胞层(Purkinje Cell Layer,PCL)及颗粒层(Granule Cell Layer,GCL)构成。神经元分化、形态发生、细胞迁移在小脑的发育中被精确地调控,由此形成小脑正常的板层结构和神经环路。而小脑的功能则建立在正确的神经元联系以及小脑环路中传入及传出纤维的整合之上。小脑不仅仅有运动方面的功能,更参与认知、情感、执行等高级功能。小脑深部的核团整合蒲肯野细胞信息后,发出传出纤维投射至丘脑、皮层、皮层下、脑干、下丘脑等区域,由此参与广泛的高级神经功能,在发育关键期小脑也能通过这些通路影响脑其它区域的神经发生及功能形成。与此同时,小脑的损伤,特别是先天性的或儿童期的损伤,可能引起神经系统发育障碍性疾病,包括自闭症、注意力缺陷多动症及进行性失语等。而最近研究发现丙泊酚能抑制小脑蒲肯野细胞神经活动,影响小脑神经环路,这提示丙泊酚可能以小脑为靶点发挥神经毒性作用。丙泊酚作为全身静脉麻醉药,引起机体应激反应,并能通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic Pituitary Gonadal Axis,HPA)影响神经内分泌内环境稳定。丙泊酚可直接作用于下丘脑,引起其相应神经核团神经元活动改变。在发育窗口期的内环境紊乱可直接影响中枢神经系统中神经元发生、突触形成、神经元联系及神经网络的形成,并且可能导致机体重要部位对神经毒性药物易损性增加。探索丙泊酚对小脑及下丘脑的影响,有利于发现更多的作用靶点,并进一步认识丙泊酚神经毒性机制,将为预防及制定更好的麻醉方案提供新的策略和理论依据。研究方法:小鼠出生后7天(Postnatal day 7,P7)给予药物处理,分别为30mg/kg及60mg/kg丙泊酚,对照组以溶剂脂肪乳同体积注射(腹腔注射)。P8时收取标本,通过比较对照组及药物处理组小脑大体组织形态差异,观察蒲肯野细胞、颗粒神经元、伯格曼细胞数量及形态变化,以明确丙泊酚对新生期小脑发育的影响;采用5-溴脱氧尿嘧啶(5-Bromo-2’-deoxyuridine,Brd U)在P8时标记小脑新生神经元并在P10及P14时观察标记的神经元在外颗粒层(External Granular Layer,EGL)、分子层(ML)、内颗粒层(Internal Granular Layer,IGL)的分布,以研究颗粒神经元P8-P10、P14迁移情况;并采用蛋白印迹分析Notch通路表达水平以深入探索丙泊酚影响小脑发育的可能途径与机制。同时,用c-Fos免疫组化筛选及确定丙泊酚对下丘脑的激活部位,进一步分析丙泊酚处理后相关神经肽精氨酸加压素(Arginine Vasopressin,AVP)及糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor,GR)表达水平以观察机体应激及内分泌改变,并用免疫组化方法观察小胶质细胞活化水平以明确丙泊酚对下丘脑的整体影响。1、丙泊酚对新生小鼠小脑发育的影响(1)P8小脑苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色中,对照组、丙泊酚低剂量组、丙泊酚高剂量组三组间小脑矢状切面面积无明显差异,第Ⅸ叶片外颗粒层厚度三组间无明显差异;(2)P8小脑CB免疫荧光染色中,丙泊酚高剂量组小脑蒲肯野细胞数量较对照组显著减少(P0.05),蒲肯野细胞树突长度明显变短(P0.05),丙泊酚低剂量组与对照组间无差异;(3)P8小脑NeuN免疫荧光染色中,对照组、丙泊酚低剂量组、丙泊酚高剂量组三组间小脑内颗粒层颗粒神经元数量无明显差异;(4)P8小脑BLBP及GFAP免疫荧光染色中,丙泊酚低、高剂量组BLBP阳性纤维数量较对照组均明显减少(P0.01,P0.01),而比较GFAP阳性纤维数量高剂量组较对照组明显减少(P0.05),其白质区域星形胶质细胞数量增多(P0.05);(5)P8小脑CB和GFAP双标免疫荧光染色中,丙泊酚高剂量组较对照组蒲肯野细胞树突与伯格曼纤维连接点数量明显减少(P0.01);(6)P10小脑HE染色中,对照组、丙泊酚低剂量组、丙泊酚高剂量组三组间小脑矢状切面面积无明显差异,第Ⅸ叶片外颗粒层厚度低剂量组、高剂量组均较对照组明显增厚(P0.01,P0.01);(7)P10小脑Brd U免疫荧光染色中,丙泊酚高剂量组中新生颗粒神经元较对照组在外颗粒层比例明显增多(P0.01),在内颗粒层比例明显减少(P0.05),而低剂量组与对照组间无明显差异。而P14小脑Brd U染色中各组颗粒神经元数量在外颗粒层、分子层及内颗粒层中分布无明显差异;(8)P8小脑蛋白印迹分析中,丙泊酚低剂量、高剂量组中Jagged1蛋白表达水平较对照组均明显下调(P0.01,P0.01),Notch1蛋白也均明显下调(P0.05,P0.01),且高剂量组Notch1蛋白表达较低剂量组下调(P0.01)。2、丙泊酚对新生小鼠下丘脑的影响(1)P8下丘脑c-Fos免疫组化染色中,丙泊酚低、高剂量组中室旁核被激活神经元数量较对照组均显著增加(P0.05,P0.001),且高剂量组较低剂量组显著增加(P0.01);(2)P8下丘脑室旁核AVP免疫荧光染色及蛋白印迹分析中,丙泊酚高剂量组表达AVP大细胞神经元数量较对照组明显增加(P0.01),AVP蛋白表达水平较对照组及低剂量组均明显上调(P0.01,P0.05),而低剂量组与对照组间无显著差异;(3)P8下丘脑室旁核GR免疫荧光染色及蛋白印迹分析中,丙泊酚高剂量组GR阳性细胞数量较对照组、低剂量组均明显上升(P0.001,P0.05),而GR蛋白表达水平丙泊酚低、高剂量组较对照组均明显上调(P0.05,P0.01),且高剂量组较低剂量组上调(P0.05);(4)P8下丘脑Iba1免疫组化染色中,丙泊酚低、高剂量组小胶质细胞数量较对照组在下丘脑背内侧区(DMHA)(P0.05,P0.01)、腹内侧区(VMHA)(P0.05,P0.001)、外侧区(LHA)(P0.01,P0.01)均明显减少。研究结论:研究结果提示:新生期丙泊酚暴露影响小脑神经发生并一过性抑制颗粒神经元迁移,同时作用于下丘脑,激活室旁核相关神经元引起内分泌及机体应激水平改变。
【图文】：

丙泊酚处理不影响P8小脑大体形态（HE染色）

蒲肯野细胞,丙泊酚,树突,免疫荧光染色

比较小脑叶片Ⅸ的相似部位，对照组和低剂量组间蒲肯野细胞的数量及树突长度均无统计学差异（P>0.05），而高剂量丙泊酚处理后，相比对照组，蒲肯野细胞数量明显减少(Vehicle 22.04±1.69; Pro60mg/kg 19.20±1.00, P<0.05; n=5)(图 2-2 G)，伴有树突长度的变短 (Vehicle 74.33±18.77; Pro60mg/kg 50.85±8.12, P<0.05; μm; n=5)(图 2-2 H)。图 2-2 丙泊酚减少蒲肯野细胞数量并抑制蒲肯野细胞树突生长（免疫荧光染色）A、D：对照组；B、E：丙泊酚低剂量组；C、F：丙泊酚高剂量组；A、B、C 为矢状切面部分叶片 CB 染色展示；D、E、F 分别为 A、B、C 方框中小脑第Ⅸ叶片的局部放大 G：统计小脑第Ⅸ叶片长轴 500μｍ长度内蒲肯野细胞数量。 H：统计小脑第Ⅸ叶片蒲肯野细胞树突长度。数据均以x SD 表示（n=5）。比例尺 A-C：200μｍ D-F：50μｍ *P<0.05。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R614

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