轴向压应力对互穿多聚物网络水凝胶组织工程髓核的生物学效应研究

发布时间：2019-11-01 22:49

【摘要】：背景:椎间盘退行性疾病(disc degenerative disease,DDD)是一类以椎间盘(intervertebral disc,IVD)髓核(nucleus pulposus,NP)退变为核心病理变化、以NP碎裂、IVD突出为主要病理结果,进而引起一系列临床症状的脊柱疾患,其人群发病率极高,严重影响中老年人的劳动能力和生活质量,已成为日益突出的社会健康问题。目前,针对DDD的治疗均以缓解和改善临床症状为目的,尚无修复退变碎裂的NP、重建IVD的生物力学功能的临床治疗手段。组织工程技术的发展为NP的再生修复展现出崭新的前景,日益受到广泛关注。目的:IVD在体内主要是发挥生物力学功能,承载着较高的应力负荷,其中NP更是承载了脊柱所受到的70%轴向应力负荷。因此组织工程髓核(tissue-engineered nucleus pulposus,TE-NP)在植入体内时应具有良好的力学性能和生物学功能,保证在较高的应力负荷下TE-NP可以维持其结构和功能,为NP组织提供再生模板,恢复IVD的生物力学功能,重建脊柱的生物力学。然而,目前TE-NP的生物力学性能的不足是限制TE-NP进一步发展的重要瓶颈问题之一。本研究旨在构建一种具有较强力学性能和生物活性的TE-NP,然后在此基础之上,研究不同强度轴向压应力对TE-NP内髓核细胞(NPCs)生物学功能的影响。方法:本课题在前期研究的基础之上,制备了一种由天然材料——氧化葡聚糖(oxidative dextran,ODex)、氨基化明胶(amino gelatin,MGel)以及合成材料——四臂聚乙二醇-丙烯酸酯(4-arm-poly-(ethylene glycol)-acrylate,4A-PEG-Acr)构成的、适用于NP修复的强化力学性能多层互穿多聚物网络(interpenetrating polymer network,IPN)水凝胶。本研究通过调整IPN水凝胶中4A-PEG-Acr的比例,检测孔径、孔隙率、力学性能、水合能力以及细胞相容性等理化性能,以优化筛选适用于TE-NP的性能最优的、仿生的IPN水凝胶,然后观察该IPN水凝胶内三维(three dimensional,3D)培养的NPCs增殖活性、生化成分含量、NP特异性基因和胞外基质(extracellular matrix,ECM)相关蛋白的表达。在此基础之上,将TE-NP置入前期自主研发的智能化反馈调控组织轴向应力仿生施加及培养系统‖中,运用不同强度的动态轴向压应力加载于TE-NP以增强其生物学功能,观察不同强度的压应力对TE-NP的细胞增殖活性、ECM合成、细胞表型、合成代谢、分解代谢、炎症相关基因表达、细胞凋亡及细胞骨架的影响,探索轴向压应力对TE-NP生物学功能的效应窗‖,寻找对TE-NP生物学功能发挥正向调控作用的轴向压应力的适宜强度。结果:(1)由4A-PEG-acr、ODex和MGel通过两步交联反应制成的IPN水凝胶是适用于NP组织工程的良好支架材料。当三者的成分比例为2:3:5时,该水凝胶具有仿生的3D结构、高孔径、高强度、高韧性、与NP类似的吸水膨胀能力以及良好的细胞相容性。接种于该水凝胶中的NPCs具有良好的增殖活力,并维持了天然的表型,具有良好的生物合成能力。(2)不同强度的轴向压应力对TE-NP的生物学功能产生了不同的影响。根据本研究发现,低强度的压应力(1%~10%)尤其是压缩量为1%的压应力可以有效地增强TE-NP的细胞增殖活性和合成代谢能力,减少了NPCs的分解代谢、炎症相关基因表达和凋亡,并维持细胞正常的类圆形结构;而高强度的压应力(15%-20%)对TE-NP的生物学功能起到了负性调节作用,导致了NPCs的分解代谢、炎症相关基因和凋亡相关基因表达的上调,合成代谢减少,波形蛋白的表达升高且细胞形态呈长梭形改变。全文结论:由4A-PEG-acr、ODex和MGel通过两步交联反应制成的IPN水凝胶是适用于NP组织工程的良好支架材料,当三者的成分比例为2:3:5时该水凝胶具有强化的力学性能和良好的细胞相容性,有利于承载一定强度的应力负荷。以该水凝胶为支架构建的TE-NP在低强度的应力作用(1-10%)尤其是压缩量为1%的低强度压应力作用下,细胞维持了天然的类圆形结构,内部细胞增殖活性和合成代谢能力明显增强,进一步增强了TE-NP的生物活性;然而,高强度的压应力作用(15%-20%)对TE-NP的生物学功能起到了负性调节的作用。本研究制备具有良好的力学性能和生物活性的TE-NP,并发现低强度压应力可以增强TE-NP的生物学功能,为其临床应用奠定了实验基础和提供了理论依据。
【图文】：

示意图,合成水,凝胶,示意图

取 5 g 的四臂 PEG 置入除去水的二氯甲烷中，蒸馏，待冷却后，向反应体系中加入 1115 ul 的三乙胺并充分搅拌混匀。随后，向反应体系中充入氮气，保证体系处于无O2的状态，将 325 ul 丙烯酸酯加入溶液中，避光反应，用恒温磁力搅拌器在 37℃下搅拌反应 24 h。反应结束后，抽滤二氯甲烷，加入无水乙醚沉淀三次后，将白色固体产物溶于双蒸水。将溶液转移至预处理过的透析袋（MWCO1000）中，放入大体积的双蒸水中进行透析，每天换水 4 次，共透析 4 天。将透析产物在超低温冰箱中预冻后置于冷冻干燥机中冻干。称重，置于真空干燥器保存。2.2.4.5 IPN 水凝胶的合成使用两步反应法合成 IPN 水凝胶。将 ODex、MGel、4A-PEG-Acr 按照 20 wt %的浓度溶于 PBS，用磁力搅拌器将其充分混匀。将 I2959 按照 1%的浓度溶于 DMSO 中，震荡混匀。将上述四种溶液同时灌注在直径为 10 mm 的圆柱形模具中，在 37℃下反应 15 min，然后用 5 mWcm-2 的紫外光（365nm）照射 5 分钟，遂成胶。IPN 水凝胶合成的步骤如图 2-1 所示。

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第三军医大学硕士学位论文充分吹打均匀，随后将水凝胶-细胞悬液加入圆柱形模具（直径=10 mm，，在37℃下反应15 min，然后用5 mWcm-2的紫外光（365nm）照射5分钟了TE-NP。将TE-NP置于本课题组前期自主研发的智能化反馈调控组织轴施加及培养系统‖（如图2-2所示）中进行长期培养液循环灌流培养，，每天
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R681.53

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