烫伤后TNF-α诱导蛋白-8样分子2介导树突状细胞免疫功能障碍及其机制

发布时间：2019-11-09 04:36

【摘要】：研究背景和目的:肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子2(tumor necrosis factor-αinduced protein 8 like-2, TIPE2)在机体免疫细胞内存在表达,可能参与烧伤后脓毒症的病理生理过程。但TIPE2表达是否影响树突状细胞(dendritic cells, DC)的免疫功能迄今尚不清楚。实验方法:1.采用免疫磁珠法分离正常BALB/c小鼠脾脏DC。采用激光共聚焦技术精确定位DC细胞内TIPE2的表达;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测TIPE2在DC细胞中的基因和蛋白表达水平。体外实验部分将携带TIPE2 siRNA/TIPE2 RNA的慢病毒载体转染至DC细胞,抑制/上调DC细胞内TIPE2基因/蛋白的表达;体内实验部分通过尾静脉注射携带TIPE2 siRNA/TIPE2 RNA的慢病毒载体,饲养两周待表达稳定后,复制小鼠重度烫伤模型。DC细胞表面抗原、共刺激分子和抗原呈递分子采用流式细胞术检测;DC对T淋巴细胞增殖反应的影响应用CCK-8法检测;DC自身分泌的细胞因子、DC/T共培养上清液中细胞因子水平的变化及T淋巴细胞核内活化T细胞的核因子(nuclear factor of activated T cells,NF-AT)活性采用ELISA检测。统计学方法:计量资料用x±s表示,采用SPSS 17.0统计软件分析各组数据,俩样本间比较采用t检验,单因素多组数据进行方差分析(One-WayANOVA)。以P0.05代表差异有统计学意义。主要结果和结论:1.激光共聚焦显微镜成像分析显示TIPE2在DC胞浆中表达,TIPE2在DC内存在基因和蛋白表达。2.流式结果显示,CD80、CD86及主要组织相容性复合体-Ⅱ类分子(MHC-Ⅱ)表达在TIPE2沉默DC细胞组显著增强,TIPE2过表达组3种表面分子的表达均明显降低。小鼠烫伤24h后,siRNA-TIPE2转染组DC表面3种分子表达均较烫伤组出现显著上调,TIPE2 RNA转染组其表达则明显下调(P，0.01)。3. ELISA结果显示,siRNA-TIPE2转染组DC细胞上清液中检测到较高水平IL-12、TNF-α(P0.01)。小鼠严重烫伤后,siRNA-TIPE2转染组IL-12、TNF-α生成量显著升高,而TIPE2RNA转染组两种细胞因子水平明显降低(P0.01)。4. CCK8法检测显示,沉默TIPE2表达后T细胞增殖活性较正常组增强。小鼠烫伤24h后,siRNA-TIPE2转染组T细胞增殖活性明显增强,TIPE2上调组T细胞增殖活性则显著减弱(P0.01)。5. TIPE2-RNA转染DC细胞后,IL-2水平及T细胞NF-AT活性显著降低。烫伤24 h后TIPE2 RNA转染组IL-2水平及T细胞NF-AT活性较烫伤组明显降低,TIPE2 siRNA转染组IL-2生成量及T细胞NF-AT活性显著升高(P0.01)。6. TIPE2 siRNA转染DC细胞后,IFN-γ生成量增加,IL-4生成量下降,T细胞向辅助性T细胞(Th) 1方向极化。与烫伤组相比,TIPE2 RNA转染组IFN-γ水平降低而IL-4含量升高,TIPE2siRNA转染组,IFN-y水平上升而IL-4含量显著降低(P0.01)。上述结果提示,TIPE2可显著影响严重烫伤小鼠DC细胞的分化成熟及其介导的T淋巴细胞功能。
【图文】：

２．３邋ＤＣ细胞Ｔ１ＰＥ２邋ｍＲＮＡ／蛋白表达逡逑收集分离纯化ＤＣ细胞，ＲＴ－ＰＣＲ检测到１４７邋ｂｐ大小的特异性ＴＩＰＥ２目的基因条逡逑带（图２），Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ证实ＤＣ细胞中存在分子量为２１邋ｋＤ的清晰ＴＩＰＥ２条带（图２）。逡逑ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞、调节性Ｔ细胞和巨噬细胞内ＴＩＰＥ２作为阳性对照，ｐ－ａｃｔｉｎ作为内逡逑参照。逡逑１３逡逑

正常ＤＣ对照组、ＴＩＰＥ２ｓｉＲＮＡ转染ＤＣ细胞组、ＴＩＰＥ２ＲＮＡ转染ＤＣ细胞组２４ｈ逡逑后，流式细胞结果经过方差分析显示，ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＭＨＣ－ＩＩ平均荧光强度在ＴＩＰＥ２逡逑沉默ＤＣ细胞组显著升高（表２－２和图２－２，，邋Ｐ＝０．０００），ＴＩＰＥ２过表达ＤＣ组３种共刺激分逡逑子的平均荧光强度明显降低（表２－２和图２－２，Ｐ＝０．０００）。如上所述，沉默ＤＣ细胞ＴＩＰＥ２逡逑表达后ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＭＨＣ－ＩＩ荧光强度均显著增强，说明ＤＣ细胞内ＴＩＰＥ２表达显逡逑著影响ＤＣ细胞的成熟分化状态。此外，小鼠脾脏ＤＣ内ＴＩＰＥ２蛋白抑制或过表达效逡逑果满意（表２－１和图２－１，邋Ｐ＝０．０００）。逡逑表２－１邋ＤＣ细胞中ＴＩＰＥ２蛋白沉默／过表达效果（三士ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ａｂｕｎｄａｎｃｅ邋ｏｆ邋ＴＩＰＥ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｉｎ邋ＤＣｓ邋（邋ｘ±ｓ）逡逑２０逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R644

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本文编号：2558251