慢病毒介导Sox9过表达和Fas干扰联合转染人退变髓核细胞的体外实验研究

发布时间：2019-11-09 03:38

【摘要】：目的:复苏低温冻存的人退变髓核细胞,并观察其活力;体外筛选最佳Fas-si RNA并构建其慢病毒载体;Sox9、Fas及Sox9联合Fas体外转染人退变髓核细胞,并研究它们在体外对人退变髓核细胞的影响。方法:复苏液氮储存的人退变椎间盘髓核细胞,对细胞进行培养,并观察其活力情况。设计Fas-si RNA-慢病毒载体,经酶切和基因测序鉴定重组克隆,对Fas-si RNA进行慢病毒包装,并检测其滴度。将Sox9过表达和Fas干扰以慢病毒为载体在体外联合转染人退变髓核细胞进行实验研究,为了便于荧光显微镜观察病毒转染效率,用红色荧光标记Sox9基因,蓝色荧光标记Fas基因。实验分为(1)空白对照组;(2)阴性对照组;(3)Sox9过表达组;(4)Fas干扰组;(5)Sox9过表达+Fas干扰组。携带目的基因的慢病毒转染人退变髓核细胞72h后,通过荧光显微镜观察,而检测病毒转染效率;CCK8检测各组细胞增殖情况;RT-PCR检测各组Sox9、Fas、Ⅱ型胶原、蛋白多糖在m RNA水平的表达情况;Western-Blot分别检测各组Ⅱ型胶原、蛋白多糖在蛋白质水平的表达。结果:人退变髓核细胞成功复苏培养后,细胞生长正常、状态良好。经酶切及重组克隆基因测序鉴定显示,应用基因重组技术成功构建Fas-si RNA慢病毒载体,检测滴度大于1x108TU/ml。荧光显微镜观察72h后(3)、(4)、(5)组的载体转染人退变髓核细胞其转染效率均达到80%以上。CCK8检测结果显示与(1)组相比(2)组细胞增殖变化不大,比较差异无统计学意义(P0.05);(3)组、(4)组、(5)组与(1)组相比细胞增殖率均有明显增高,其中(5)组的细胞增殖率增高最为显著,比较差异有统计学意义(P0.05)。运用RT-PCR检测方法证实在Sox9、Fas、Ⅱ型胶原和蛋白多糖m RNA表达水平上(1)组与(2)组相比变化不大,比较差异无统计学意义(P0.05);(3)组中Sox9的m RNA表达升高明显,(4)组中Fas的m RNA表达水平降低明显,(5)组中Sox9的m RNA表达水平升高最为显著、Fas的m RNA表达水平降低最为显著,与(1)组比较差异具有统计学意义(P0.05)。Western-blot检测结果表明与(1)组相比(2)组Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达变化不明显,比较差异无统计学意义(P0.05);(3)组、(4)组Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达均有明显升高,(5)组升高最为显著,与(1)组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:慢病毒介导的Fas-si RNA可以显著抑制人退变髓核细胞中Fas基因的表达;上调Sox9基因的表达及沉默Fas基因的表达能够增加人退变髓核细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达量,实验结果显示Sox9和Fas基因与椎间盘退变有相关性,通过此生物学效应有望阻止或逆转椎间盘退变。
【图文】：

形态图,退变,形态,培养箱

结果结果复苏后形态观察退变髓核细胞复苏后，，显微镜下观察细胞呈圆形状（如图 1），培养箱培养 1 周，显微镜下观察人退变髓核细胞贴壁生长呈长梭常，状态良好（如图 2）。

形态图,退变,干扰效果,形态

状态良好（如图 2）。图 1 人退变髓核细胞复苏未贴壁时形态图2 人退变髓核细胞贴壁后形态2 实时荧光定量 PCR 检测 Fas 干扰效果可以看出三条 Fas-siRNA 干扰效果都比较明显（如图 3)，而 Fas-siRNA-1053 干扰效果最佳，选择 Fas-siRNA-1053 进行慢病毒包装。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R681.53

【参考文献】