【摘要】：背景骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤,好发于青少年和儿童,恶性程度高且较早发生转移,严重影响患者的身心健康。虽然经过新辅助化疗、外科手术、放疗等综合治疗,患者的5年生存率提高至60%-80%,但临床上仍有较多患者存在局部复发和转移的风险,预后差。骨肉瘤的复发和转移是影响患者存活率的重要因素,但目前关于骨肉瘤发生和转移的机制尚未明确,因此有必要探究骨肉瘤发生侵袭和转移的具体机制,进一步提高患者的存活率。miRNA(microRNAs)与肿瘤的发生发展密切相关,参与多种肿瘤的生长、分化、转移、细胞凋亡,miRNA与骨肉瘤的相关性研究较少。已有研究发现miR-100在多种恶性肿瘤中表现为低表达,并抑制恶性肿瘤的增殖和转移,我们在预实验中已经证实miR-100在骨肉瘤细胞株中低表达,需进一步明确miR-100对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移能力的影响。目的明确miR-100在骨肉瘤细胞中的表达水平,研究过表达miR-100对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,为骨肉瘤的基因靶向治疗提供理论依据和新手段。方法1.采用实时荧光定量PCR技术检测miR-100在骨肉瘤细胞株HOS、U-2OS、Saos-2、MG-63和正常成骨细胞NHOst中的表达水平。2.在骨肉瘤细胞株MG-63中采用脂质体2000瞬时转染技术分别转染miR-100 mimics、miR-100 NC,构建骨肉瘤细胞干预模型,设为miR-100组(转染miR-100 mimics)、miR-100 NC组(转染miR-100 NC)、control组(只加入脂质体2000);实时荧光定量PCR技术检测miR-100在miR-100组、miR-100NC组和control组中的表达水平,验证miR-100的转染效率。3.分别在转染0h、24h、48h、72h、96h后取细胞进行CCK-8增殖实验,酶标仪测定波长在450nm的吸光度,比较不同时间点miR-100组、miR-100 NC组和control组之间细胞增殖能力。4.构建细胞模型成功后,在含有matrigel的小室中行Transwell侵袭实验,光镜下进行视野计数,比较miR-100组、miR-100 NC组和control组之间细胞侵袭能力的变化。5.构建细胞模型成功后,在不含matrigel的小室中行Transwell迁移实验,光镜下进行视野计数,比较miR-100组、miR-100 NC组和control组之间细胞迁移能力的变化。结果1.通过实时荧光定量PCR检测发现miR-100在骨肉瘤细胞株HOS(P=0.004)、U-2OS(P=0.000)、Saos-2(P=0.017)、MG-63(P=0.000)中表达水平均显著低于正常成骨细胞NHOst,具有统计学差异,表明与NHOst相比miR-100在骨肉瘤细胞株中低表达。2.骨肉瘤细胞株MG-63转染实验表明miR-100组表达量明显高于miR-100 NC组和control组,miR-100组与miR-100 NC组之间存在统计学差异(P=0.000),miR-100组与control组之间存在统计学差异(P=0.000),miR-100 NC组和control组之间无统计学差异(P=0.992),表明miR-100转染骨肉瘤细胞模型构建成功。3.CCK-8增殖实验发现在转染0h时间点后miR-100组、miR-100 NC组和control组之间CCK-8 OD_(450nm)值大致相近,三组之间比较无统计学差异(P=0.439);在转染24h、48h、72h、96h时间点后miR-100组CCK-8 OD_(450nm)值均低于miR-100 NC组及control组,miR-100组和miR-100NC组之间存在统计学差异(P0.05),miR-100组和control组之间存在统计学差异(P0.05),miR-100 NC组和control组之间无统计学差异(P0.05);与miR-100NC组、control组相比miR-100组增殖曲线图明显下移,表明过表达miR-100抑制骨肉瘤细胞的增殖。4.Transwell侵袭实验发现miR-100组通透基底膜细胞数量明显低于miR-100 NC组、control组,miR-100组和miR-100 NC组之间存在统计学差异(P=0.000),miR-100组和control组之间存在统计学差异(P=0.000);miR-100 NC组和control组细胞数量大致相近,两组之间无统计学差异(P=0.904);提示过表达miR-100抑制了骨肉瘤细胞的侵袭能力。5.Transwell迁移实验发现miR-100组进入下室的细胞数量明显低于miR-100 NC组、control组,miR-100组和miR-100 NC组之间存在统计学差异(P=0.000),miR-100组和control组之间存在统计学差异(P=0.000);miR-100 NC组和control组细胞数量大致相同,两组之间无统计学差异(P=0.880);提示过表达miR-100抑制了骨肉瘤细胞的迁移能力。结论1.与正常成骨细胞NHOst相比miR-100在骨肉瘤细胞株中低表达。2.在骨肉瘤细胞株中过表达miR-100可以抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。3.miR-100可以成为骨肉瘤治疗的靶向基因,为骨肉瘤的治疗带来一种新的方法。
【图文】：
3.1 四种骨肉瘤细胞株中 miR-100 和内参反应曲线骨肉瘤细胞株HOS、U-2OS、Saos-2、MG-63中miR-100和内参引物溶解曲线分别如图3-1、3-2所示，miR-100和内参引物扩增曲线分别如图3-3、3-4所示。观察各细胞系引物溶解曲线图可见miR-100和内参U6均为单一尖锐峰，表明特异性良好，扩增后未形成非特异性产物，扩增效果较好。图3-1 各细胞株中miR-100引物溶解曲线（A.HOS B.U-2OS C.Saos-2 D.MG-63）图3-2 各细胞株中U6引物溶解曲线（A.HOS B.U-2OS C.Saos-2 D.MG-63）
成非特异性产物，扩增效果较好。图3-1 各细胞株中miR-100引物溶解曲线（A.HOS B.U-2OS C.Saos-2 D.MG-63）图3-2 各细胞株中U6引物溶解曲线（A.HOS B.U-2OS C.Saos-2 D.MG-63）
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738.1
【参考文献】
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