右美托咪定促进小鼠肝切除后肝再生的机制研究

发布时间：2020-03-18 22:57

【摘要】：肝切除术后肝再生和肝功能保护是决定患者预后的重要环节,因此肝切除围术期肝缺血再灌损伤是尤其需要关注的。组织缺血再灌损伤后的修复和再生过程复杂,大量的分子途径被证明与之相关并发挥重要作用。NOD样受体(NOD-like receptors,NLRs)介导的炎性小体的激活在细胞增殖活动中发挥着重要作用,其中NLRP3炎性小体一直被认为是可以感应最多种类的外界刺激。但NLRP3炎性小体在肝部分切除(partial hepatectomy,PHx)后的肝再生(liver regeneration)过程中的作用仍然是未知的。目前研究已证明,TLR4/NF-κB信号通路在NLRP3炎性小体的活化以及肝再生的过程中均发挥重要的调控作用,并且右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)也被证明可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活性来进而保护肝脏缺血再灌注造成的组织损伤。本课题将进一步探索右美托咪定能否促进肝部分切除后的肝再生过程,同时考察右美托咪定在该过程中对炎性小体的活性的影响。第一部分:右美托咪定体外对人正常肝细胞作用的实验研究目的:探索右美托咪定对L02人正常肝细胞的影响及其可能的分子机制。方法:在体外实验中,观察不同浓度的右美托咪定的处理对L02人正常肝细胞的增殖、凋亡的影响。Western印迹检测TLR4/NF-κB蛋白的表达水平。采用MTT检测细胞增殖的变化。结果:在体外,右美托咪定能够明显抑制L02人正常肝细胞的增殖,但是不具有剂量依赖性。右美托咪定明显的降低L02人正常肝细胞内TLR4和NF-κB蛋白的表达水平。结论:我们推测,右美托咪定抑制人肝细胞的增殖作用,与其抑制TLR4/NF-κB信号通路的强度的作用有关。第二部分右美托咪定促进小鼠肝切除后肝再生的实验研究目的:右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)已经被证明是可以保护肝脏缺血再灌注造成的组织损伤,而炎症在肝再生的过程中发挥重要作用。因此在本课题中,我们的目的是探索右美托咪定能否促进小鼠肝部分切除后的肝再生过程,同时考察右美托咪定在该过程中对TLR4/NF-κB蛋白的影响。方法:在体内实验中,我们对C57BL/6小鼠进行70%肝部分切除以建立动物模型,作为模型组(PHx group);将单纯行腹部切开、肝脏分离后关闭腹腔的正常小鼠作为假手术组(sham group);接受右美托咪定治疗的模型小鼠随机分为两组:在肝部分切除的前30分钟接受单次腹腔注射右美托咪定(25μg/kg)的小鼠作为Dex+PHx组;而肝部分切除的前30分钟、术后24h、48h、72h分别接受腹腔注射右美托咪定(25μg/kg)的小鼠作为Dex+PHx+Dex组。观察Dex对肝切除后肝重/体重比值的影响;检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平;HE染色观察肝脏组织病理变化;Western印迹检测TLR4/NF-κB蛋白的表达水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β和TNF-α水平。结果:1.与PHx组相比,Dex+PHx组肝脏重量/体重比值的增加明显升高,而Dex+PHx+Dex组的肝脏重量/体重比值明显低于PHx组和Dex+PHx组。2.与PHx组相比,在Dex+PHx组,血清ALT和AST水平明显降低,而Dex+PHx+Dex组血清ALT和AST的水平显著升高。3.在PHx组血浆中IL-1β和TNF-α与对照组相比显著增加,Dex+PHx和Dex+PHx+Dex组血浆中IL-1β和TNF-α较对照组升高同时较PHx组显著降低。4.TLR4和NF-κB在Dex+PHx+Dex组明显抑制,而PHx组和Dex+PHx组之间没有显著差异。结论:在体内,小鼠肝部分切除后,TLR4/NF-κB信号通路的活性显著增强。Dex+PHx组结果说明右美托咪定对小鼠肝部分切除后的肝再生和肝功能的恢复具有明显的的促进作用,这可能与右美托咪定抑制肝部分切除后炎症反应的强度的作用有关。而Dex+PHx+Dex组的结果说明过量的右美托咪定能够抑制小鼠肝部分切除后的肝再生以及抑制肝功能的恢复,而该现象可能与右美托咪定过度抑制TLR4/NF-κB信号通路的强度有关。所以,术前给予右美托咪定可以通过抑制炎症促进了小鼠肝再生和肝脏功能的恢复;但是术后继续给予右美托咪定却能够过度地抑制TLR4/NF-κB信号通路,会抑制肝细胞再生以及肝功能恢复,提示术前给予右美托咪定可能成为临床促进肝再生的一种有效的治疗策略。第三部分右美托咪定促进小鼠肝切除后肝再生分子机制的实验研究背景:NOD样受体(NOD-like receptors,NLRs)介导的炎性小体的激活在细胞增殖活动中发挥着重要作用。而其中NLRP3炎性小体被认为可以感应最多种类的外界刺激。但NLRP3炎性小体在肝部分切除(partial hepatectomy,PHx)后的肝再生(liver regeneration)过程中的作用仍然是未知的。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)已经被证明可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活性来保护肝脏缺血再灌注造成组织损伤,而该信号通路已经被证实在NLRP3炎性小体的活化以及肝再生的过程中均发挥重要的调控作用。因此在本课题中,我们的目的是探索右美托咪定促进肝部分切除后的肝再生过程中对炎性小体活性的影响。方法:在体内实验中,我们对C57BL/6小鼠进行70%肝部分切除以建立动物模型,作为模型组(PHx group);将单纯行腹部切开、肝脏分离后关闭腹腔的正常小鼠作为假手术组(sham group);接受右美托咪定治疗的模型小鼠随机分为两组:在肝部分切除的前30分钟接受单次腹腔注射右美托咪定(25μg/kg)的小鼠作为Dex+PHx组;而肝部分切除的前30分钟、术后24h、48h、72h分别接受腹腔注射右美托咪定(25μg/kg)的小鼠作为Dex+PHx+Dex组。western印迹检测NLRP3炎性小体,ACS,Caspase-1等蛋白的表达水平。结果:在体内,小鼠肝部分切除后NLRP3炎性小体的活性升高,cleaved-caspase-1,ACS表达上调,IL-1β和TNF-α在PHx组血浆中与对照组相比显著增加。Dex+PHx和Dex+PHx+Dex组均明显抑制了炎症反应。结论:右美托咪定预处理可以通过抑制NLRP3炎性小体的活性防止PHx后肝脏的炎症损伤,从而促进了肝再生和肝脏功能的恢复。但预处理和后处理时,过量的右美托咪定会过度地抑制NLRP3炎性小体的活性,从而降低炎性细胞因子的表达活化及分泌。伴随TLR4/NF-κB活性的降低,肝细胞再生以及肝功能恢复也会抑制,说明TLR4/NF-κB信号通路及其介导的反应在肝切除后肝再生过程中发挥着微妙的作用,只有适当的抑制才可以促进肝再生。
【图文】：

独立实验,信号通路,数据显示,吸光度

图 1 L02 细胞增殖率1.右美托咪定抑制 L02 肝细胞增殖。L02 细胞用不同浓度的右美托咪定孵育 24 小时。测细胞增殖率。值为检测处的吸光度。四个独立实验的数据显示为平均值±SD。np＜0.01 vs 对照。右美托咪定抑制人肝细胞内 TLR4/NF-κB 信号通路活性

蛋白表达

为了进一步探讨 TLR4 和 NF-κB 在肝细胞增殖的作用，L02 细胞在 20μM 的右美托咪定处理后，利用 Western blot 检测蛋白表达，，结果（图 2）表明，TLR4 和NF-κB 蛋白表达明显下降，提示右美托咪定抑制肝细胞增殖的作用，可能取决于其对 TLR4 和 NF-κB 抑制作用。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614

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