人激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞差异表达microRNA筛选及功能研究

发布时间：2020-03-19 16:20

【摘要】：研究背景:1953年,皮质类固醇药物引起股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)的现象被发现。目前,长期或大量使用激素已成为非创伤性股骨头坏死的首要发病因素。激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)是由于应用激素类药物,导致股骨头血液供应受损,多种骨基质细胞死亡,进而导致股骨头承重区骨小梁结构改变,股骨头不可逆性塌陷,最终导致髋关节功能障碍的代谢性疾病。最终,大多数患者不得不进行人工关节置换术治疗,严重影响患者的生活质量,并给社会带来了巨大负担。多年来,对SONFH发病机制的探究不断深入,众多学说被提出,其中包括脂质代谢紊乱学说、骨髓间充质的细胞成骨能力减弱学说、炎症与细胞凋亡学说、血液供应不足学说、基因多态性等等。然而,SONFH的确切病理过程尚不完全清楚,仍需要进一步深入研究。因此,探究SONFH的发病机制,对疾病的预防、早期诊断、治疗存在重要意义。最新研究发现,SONFH患者的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)增殖能力下降,且成骨分化能力减弱、成脂分化能力增强。BMSC是骨髓中一种多能干细胞,可分化为多种骨基质细胞,并且在多种疾病发生发展过程中具有重要病理生理作用。既往研究发现,骨髓间充质干细胞功能紊乱与多种代谢性骨病的发生、发展过程相关,如骨质疏松症、膝关节骨性关节炎、强直性脊柱炎、骨肉瘤等。BMSC在代谢性骨病中调控作用成为近年来的研究热点。micro RNA(miRNA)是一种长度为18-24 nt的内源性单链非编码RNA分子,在动植物中参与基因的转录后调控,通过碱基互补配对的方式与靶基因m RNA 3'端非翻译区(3'-UTR)结合,通过抑制其翻译和/或促进其降解的方式抑制靶基因表达。部分miRNA已被证明参与调控BMSC的增殖和多向分化过程,并发挥重要作用。目前,激素刺激导致BMSC miRNA表达谱变化尚不明确,探究SONFH患者BMSC miRNA表达谱变化对SONFH的早期诊断和治疗具有重要意义。本实验应用miRNA基因芯片筛选SONFH患者与股骨颈骨折(femoral neck fracture,FNF)患者BMSC差异表达的miRNA,通过生物信息学分析预测miRNA调控的靶基因和信号通路,并检测miRNA在BMSC成骨/成脂分化过程中的变化趋势,明确miRNA与BMSC成骨/成脂分化的相关性,为明确激素性股骨头坏死发病机制提供实验基础。研究方法:1、BMSC分离、培养和鉴定:从3例股骨颈骨折和3例激素性股骨头坏死行全髋关节置换术的患者股骨近端髓腔内抽取骨髓,用密度梯度离心法,分离获得BMSC进行体外培养,并对细胞表型、成骨/成脂能力进行初步鉴定。2、miRNA基因芯片筛选差异表达表达miRNA:对三代股骨颈骨折BMSC和激素性股骨头坏死BMSC提取总RNA,应用miRNA基因芯片检测miRNA表达情况,筛选得到差异表达的miRNA,并通过q RT-PCR验证miRNA表达差异。3、差异表达的miRNA生物信息学分析:对差异表达的miRNA进行靶基因预测、GO分析和KEGG分析,预测miRNA参与调控的细胞进程和信号通路。4、BMSC成骨/成脂分化过程中miRNA表达变化趋势检测:体外诱导BMSC成骨、成脂分化,以诱导周期为时间点提取BMSC总RNA。利用q RT-PCR检测BMSC成骨、成脂分化过程中miRNA表达变化趋势,明确差异表达的miRNA与BMSC成骨、成脂分化的相关性。结果:1、成功分离、体外培养获得BMSC,应用流式细胞术对其表面标志物进行了鉴定,CD29+(98.86%)、CD90+(96.42%)、CD34-(9.12%),并通过诱导成骨/成脂分化和相关染色确定了其潜在的成骨/成脂分化能力。2、经miRNA基因芯片检测,miR-4298、miR-4425、miR-601、miR-452-3p、miR-582-5p、miR-647、miR-5006-3p、miR-516b-5p、miR-668-3p、miR-513b-5p、miR-3687、miR-181a-3p、miR-1246、miR-4436b-3p、miR-3976、miR-4530、miR-4421等17个miRNA表达上调,miR-127-5p、miR-887-3p、miR-519e-3p、miR-933、miR-122-3p等5个miRNA表达下调。3、经q RT-PCR验证,miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-122-3p在激素性股骨头坏死和股骨颈骨折BMSC中表达量存在显著性差异,且与miRNA基因芯片检测结果一致。4、miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-127-5p在BMSC成骨分化过程中表达量呈下降趋势,在成脂分化过程中表达量逐渐升高,而miR-122-3p在BMSC成骨分化过程中表达量逐渐升高,在成脂分化过程中表达逐渐降低。5、生物信息学分析发现,miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-127-5p、miR-122-3p的靶基因主要富集在泛素介导的蛋白水解通路(ubiquitin mediated proteolysis)、肿瘤胆碱代谢(choline metabolism in cancer)、糖酵解与糖异生(glycolysis/gluconeogenesis)等信号通路。结论:1、筛选出激素性股骨头坏死BMSC特异性miRNA表达谱变化。2、miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-127-5p、miR-122-3p可能通过泛素介导的蛋白水解(ubiquitin mediated proteolysis)、肿瘤胆碱代谢(choline metabolism in cancer)、糖酵解与糖异生(glycolysis/gluconeogenesis)等信号通路调节BMSC增殖、分化和凋亡等过程。3、miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-127-5p可能为BMSC成骨分化负性调节因子,抑制成骨分化、促进成脂分化;miR-122-3p可能为BMSC成骨分化正向调节因子,促进成骨分化、抑制成脂分化。
【图文】：

发病机制,激素性股骨头坏死

激素性股骨头坏死的复杂发病机制

激素性股骨头坏死,股骨头坏死,股骨颈骨折,髋关节

第 2 章人骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定编号性别年龄诊断基础疾病激素应用时长B3 女 60 右股骨头坏死系统性红斑狼疮 1.5 年B4 男 69 右股骨头坏死哮喘 1 年B5 男 55 左股骨头坏死间质性肺病 1 年B6 女 68 右股骨头坏死系统性红斑狼疮 1.5 年B7 女 68 双侧股骨头坏死哮喘 4 年B8 女 56 右股骨头坏死系统性红斑狼疮 2 年B9 男 61 右股骨头坏死间质性肺病 2 年
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.8

【参考文献】