【摘要】：目的:探索BMP-7在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为神经元的作用。方法:以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs。流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44。成脂诱导及油红O染色鉴定大鼠BMSCs多向分化能力。MTT法检测浓度分别为25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml及100ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs增殖的影响。倒置相差显微镜下观察25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml及100ng/ml的BMP-7诱导大鼠BMSCS后形态学变化,并取形态学变化最显著的进行后续实验。qRT-PCR检测诱导得到的细胞神经丝蛋白200(Neurofilament protein-200,NF200)、突触蛋白1(Synaptic protein 1,SYN1)、微管相关蛋白2(Microtubule-associated protein-2,MAP2)、胶质纤微酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)mRNA相对表达量。免疫组化检测诱导得到的细胞NF200、MAP2、SYN1、GFAP蛋白表达情况。免疫荧光实验检测诱导得到的细胞NF200、SYN1、MAP2、GFAP蛋白表达情况。Western Blot实验检测诱导得到的细胞NF200、SYN1、MAP2、GFAP蛋白表达情况。结果:体外培养的第3代大鼠BMSCs细胞胞浆丰富,多呈长梭形,部分为多角形,细胞聚集生长呈漩涡状。分离培养得到的大鼠BMSCS阳性表达CD29、CD44,阳性率分别为99.44%、99.17%。大鼠BMSCs成脂诱导28天后胞浆内出现脂滴,油红O染色阳性。MTT实验结果表明25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml及100ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs的增殖均具有促进作用,其中75ng/ml的BMP-7促进大鼠BMSCs增殖作用最显著。形态学观察结果表明25 ng/ml BMP-7组、50 ng/ml BMP-7组、75 ng/ml BMP-7组、100 ng/ml BMP-7组细胞形态均有不同程度的变化,尤以75 ng/mlBMP-7组细胞形态学变化最为显著,形态上类似于神经元细胞。大鼠BMSCs经BMP-7(75 ng/ml)诱导2 h后,BMP-7组NF200 mRNA相对表达量为(5.47±0.59)显著高于对照组(P0.05),BMP-7组SYN1 mRNA相对表达量(1.48±0.38)显著高于对照组(P0.05),BMP-7诱导组MAP2 mRNA相对表达量(2.86±1.65)显著高于对照组(P0.05),BMP-7诱导组GFAP mRNA相对表达量(4.41±0.13)显著高于对照组。免疫组化结果表明大鼠BMSCs经BMP-7诱导2 h后,阳性表达NF200、MAP2及SYN1,阴性表达GFAP。免疫荧光结果表明大鼠BMSCs经BMP-7诱导后2 h后,诱导得到的细胞阳性表达NF200、MAP2、SYN1,且主要在胞浆及形成的突起中表达,阴性表达GFAP。Western Blot实验结果表明大鼠BMSCs经BMP-7诱导2h后,BMP-7组NF200的相对表达量(1.091±0.0060)显著高于对照组(0.4385±0.0046)(p0.01),BMP-7组SYN1的相对表达量(1.293±0.0029)显著高于对照组(0.9885±0.0018)(p0.01),BMP-7组MAP2的相对表达量(1.167±0.0045)显著高于对照组(0.9697±0.0031)(p0.01),BMP-7组GFAP的相对表达量(0.6130±0.0012)显著低于对照组(0.9286±0.0029)(p0.01)。结论:1.BMP-7具有促进大鼠BMSCs增殖的作用。2.BMP-7诱导大鼠BMSCs向神经元分化的最佳浓度为75 ng/ml。3.BMP-7诱导大鼠BMSCs得到的细胞在形态上与神经元细胞相似,阳性表达神经元细胞标志物,证实BMP-7在体外具有诱导大鼠BMSCs分化为神经元的作用。
【图文】：
图 1 大鼠 BMSCs 的形态学观察（a：×100 b：×400）Fig.1 Morphological observation of rat BMSCs (a: × 100 b: × 400)2. 大鼠 BMSCs 细胞表型 CD29、CD44 的表达情况流式细胞仪检测分离、培养得到的大鼠骨髓间充质干细胞细胞表型 CD29、CD44的结果显示，分离、培养得到细胞均一表达 CD29、CD44，阳性率分别为 99.44%、99.17%。
诱导至第 7d 可见胞浆内出现小油滴，见图3a；随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增多并融合为较大的脂滴，见图 3b；诱导 4w 后行油红 O 染色，，经油红 O 染色，显微镜观察，可见脂滴均着橘红色，见图 3c、d。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.2
【参考文献】
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本文编号：
2591379
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