成骨细胞分化过程中肿瘤坏死因子α对GLUT1表达的调节及可能机制

发布时间：2020-03-20 06:40

【摘要】：骨相关疾病随着人口老龄化到来发病率越来越高,骨疾病中骨量减少、骨硬化、骨质疏松等与骨分化紊乱相关,而骨分化紊乱的发生常伴随炎症因子升高等现象。因此探究炎症因子对骨分化的调节及其可能机制是非常重要的。骨分化是一种骨形成过程,骨形成和骨重吸收之间平衡性决定骨骼的强度和完整性。骨形成和骨重吸收的不平衡会导致多种骨疾病,比如股骨头坏死、骨质疏松、创伤性骨病和代谢性骨疾病,在类风湿性关节炎病人体内,肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor alpha,TNFα)的水平和活性增强,破坏病人的关节和骨;同样糖尿病及肥胖症患者体内也有较高水平的TNFα表达,其骨密度及骨量相较健康人而言都较低,更易得骨质疏松症,而抗TNFα疗法是提高骨矿密度的有效方法。之前的研究主要关注TNFα通过与其细胞表面受体结合,激活包括细胞核因子κB(nuclear factor-Kappa B,NF-κB)信号途径在内的多条信号途径而调节破骨细胞的分化、激活和凋亡,而TNFα对成骨细胞分化及功能的调节机制尚不清楚。因此研究TNFα对成骨细胞的分化的调节机制可能为炎症性骨疾病的治疗提供新的靶点。有研究表明葡萄糖是成骨细胞的主要营养物质,葡萄糖以胰岛素依赖的方式利用葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter1,Glut1)在成骨细胞中穿梭,Glut1在骨骼形成的过程中先于成骨特异性转录因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)表达,Runx2的累积和成骨分化必须有足够葡萄糖来提供能量。TNFα影响Glut1的表达在癌细胞中已有研究,但在成骨细胞分化中是否通过调节Glut1来起作用还不清楚。所以基于以上,论文首先利用前成骨细胞MC3T3-E1检测TNFα对成骨细胞分化的影响。用免疫印迹(Western blot,WB)、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)酶活检测等实验,检测TNFα对成骨分化标志基因和蛋白表达的影响。为进一步探索TNFα影响成骨细胞分化的分子机制,敲降p65来探究NF-κB信号通路在其中的作用。此外,我们观察到TNFα对Glut1的调节效果,敲降和过表达Glut1来探究Glut1在TNFα影响成骨分化过程中的作用。在MC3T3-E1细胞中,主要研究结果:(1)TNFα可以激活MAPK、AKT和NF-κB信号通路。(2)TNFα可以抑制成骨分化。实时荧光定量PCR和WB结果表明TNFα抑制成骨分化标志基因和蛋白的表达,同时ALP酶活检测证明TNFα对碱性磷酸酶酶活的抑制作用具有浓度依赖性。(3)敲降p65增加了成骨分化标志蛋白Runx2的蛋白表达,但不能拯救TNFα对Runx2的抑制作用。(4)TNFα短时间处理增加Glut1的蛋白表达,长时间处理抑制Glut1的蛋白表达。(5)敲降Glut1降低Runx2的蛋白表达,ALP染色和ALP酶活检测结果证明,敲降Glut1降低成骨分化过程中ALP的表达和酶活。过表达Glut1上调了Runx2的蛋白表达,但不能拯救TNFα对Runx2的抑制作用。结论:在MC3T3-E1细胞中,TNFα可以激活MAPK、AKT、NF-κB信号通路;TNFα抑制成骨分化;抑制NF-κB信号通路可以促进Runx2的表达,但不能拯救TNFα对Runx2的抑制效果,这证明了TNFα不是完全通过NF-κB信号通路来影响成骨细胞分化;另外,TNFα可以影响Glut1的表达,Glut1可以调控Runx2的蛋白表达水平,然而,过表达Glut1不能阻止TNFα对Runx2的抑制作用。这些结果表明TNFα对Runx2以及骨化作用的影响是通过多条通路协同进行的。我们的结果进一步对TNFα影响成骨分化的分子机制进行了探究,可能为炎症性骨疾病的治疗提供新的靶点。
【图文】：

细胞,肿瘤坏死因子α,成骨细胞分化,标志基因

第部分成骨细胞分化过程中肿瘤坏死因子α对GLUT1表达的调节及可能机制OPG、OPN 表达情况，发现各标志蛋白在不同时间都有不同程度的表达上调（图3.1A）。在细胞成骨分化不同天数提取 RNA 样品，实时荧光定量 PCR 检测各成骨分化标志基因 Runx2、OPG、BSP、ALP、OC 的表达情况，发现其 mRNA 水平在不同时间开始有不同程度的表达上调，并且与相应蛋白表达水平相致（图 3.1B）。MC3T3-E1 细胞成骨分化 21 天，做 Von Kasso 染色，检测 MC3T3-E1 细胞成骨矿化能力，结果显示该细胞有明显的矿化现象（图 3.1C）。 MC3T3-E1 细胞成骨分化 7 天提取蛋白样品，检测碱性磷酸酶活性，结果显示碱性磷酸酶活性在分化过程中有所增加，且与 mRNA 表达水平致（图 3.1D）。证明了 MC3T3-E1 细胞有良好的分化和矿化能力。

分布情况,信号通路,标志基因

图 3.2 TNFα 对 MAPK、AKT、NF-κB 信号通路的影响。A.分别用 0、1、10、30 ng/ml TNFα的浓度梯度处理 MC3T3-E1 细胞 24h，提蛋白后 WB 检测 ERK、p38 和 JNK 蛋白的表达情况。B.分别用 10 ng/ml TNFα 处理 MC3T3-E1 细胞 0、10、30 min 和 3、6、24 h，，提蛋白后检测AKT、ERK、p38、JNK 及其磷酸化蛋白表达情况。C.用 10 ng/ml TNFα 和等体积的 DMSO 处理 MC3T3 细胞 24 h，免疫荧光检测 NF-κB p65 蛋白在细胞中的分布情况。3.3 TNFα 长时间处理激活 NF-κB 信号通路并抑制成骨分化已经证明 TNFα 能够激活 NF-κB 信号通路，进步检测 10 ng/ml TNFα 对成骨分化的影响，在长时间分化的不同时间点，提取蛋白样品，检测 TNFα 持续处理MC3T3-E1 细胞对各成骨分化标志蛋白 Runx2、OPG、OC、OPN 表达的影响，发现在长时间分化处理过程中 TNFα 可以抑制成骨分化标志蛋白的表达水平，同时TNFα 对 NF-κB 信号通路表现为持续激活（图 3.3A）。 Q-PCR 显示检测成骨 10ng/ml TNFα 对成骨分化标志基因 Runx2、OPG、BSP、ALP、OC 的影响，发现 TNFα可以明显抑制各成骨分化标志基因 mRNA 水平的表达，与相应蛋白表达的抑制效
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68

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