慢病毒介导热休克蛋白目的片段至人脐带间充质干细胞干预皮瓣缺血再灌注损伤

发布时间：2020-03-21 14:21

【摘要】：目的为提高皮瓣缺血再灌注损伤的治疗效果,该实验将热休克蛋白90α(Hsp90α)功能片段与腺病毒相结合,通过病毒转染的方式介入至人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)内。采用点状注射的途径应用于大鼠皮瓣缺血再灌注损伤模型。观察各个时间段皮瓣颜色、毛发生长、坏死面积等宏观现象和HE染色、免疫组化等微观现象。总体探讨携带Hsp90α功能片段的h UC-MSCs对皮瓣缺血再灌注损伤的治疗效果,为后续实验研究提供理论依据及实验基础。方法在本次实验中,我们选用三种质粒(包括目的质粒载体)共同转染293T细胞,并在转然后的一定时间内提取尚未纯化处理的细胞上清液,根据实验需求浓缩纯化细胞上清液,制备成所需滴度的腺病毒原液,超低温冰箱保存。同时取样检测腺病毒的各项指标,以便用于实验研究。其次,在含10%胎牛血清的DMEM(低糖)培养基中培养、传代h UC-MSCs;在状态良好的干细胞中加入制备好的腺病毒,培养一段时间后在电子显微镜下观察并确定转染的最佳MOI值。通过MTT和q PCR检测腺病毒对h UC-MSCs的毒性及转染后h UC-MSCs的增殖能力;细胞划痕实验检测携带目基因的h UC-MSCs迁移效果。然后,选取96只成年大鼠,随机分为携带“F-5”基因组;“空载病毒”组;未转染组;未注射处理组。在无菌环境下制备大鼠腹部3×6cm岛状皮瓣,皮瓣深达深筋膜,钝性分离皮瓣,找到腹壁动静脉(股动静脉分支),玻璃分针小心分离腹壁动静脉与皮肤,最后完全离断腹部皮肤,制备成只有腹部动静脉供血的岛状皮瓣,用微型血管夹夹闭血管8小时。最后,取含有目的基因的h UC-MSCs、携带空载腺病毒的h UC-MSCs和正常h UCMSCs分组培养,制备成浓度为4×105/ml的细胞悬液。待动物模型制备成功后,在腹部岛状皮瓣上选取10个注射点行皮下注射,每个注射点间隔1cm,每点注射量为0.1 ml。为降低实验影响因素,设置注射等量生理盐水组做为对照组。从各实验组中随机选取1天、3天、5天、7天大鼠,全身麻醉,使用数码相机拍照记录皮瓣颜色、毛发生长情况,使用Image-Pro-plus软件评估皮瓣成活面积;HE染色观察皮肤组织层次和毛细血管密度变化;免疫组化(IHC)检测动物皮瓣血管周边CD31表达情况。结果注射携带“F-5”基因h UC-MSCs组的动物模型,腹部皮瓣颜色和毛发生长情况均优于其它实验组,皮瓣存活面积可达16.5cm2,较对照组有明显提高。免疫组化结果显示携带“F-5”基因组的皮瓣血管周边CD31含量远高于空载病毒组、未转染组和生理盐水组。结论实验采用“干细胞/基因”联合治疗的新方法。通过组织工程技术成功将Hsp90α中的“F-5”基因片段转染入h UC-MSCs,并用于改善大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤。通过细胞学和组织学方面的检测验证出携带“F-5”基因片段的h UCMSCs能有效改善皮瓣缺血再灌注损伤。
【图文】：

示意图,腺病毒,转染,示意图

1.2.4 MTT 细胞学检测选用传代后 3 天的 hUC-MSCs 制备成含 10％胎小牛血清的单个细胞悬液，以每孔 1000 个细胞接种到 96 孔板，，每孔体积 200ul，每孔加 MTT 溶液 10ul（MTT 浓度为 5mg/ml）。继续孵育 4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔 100ulDMSO，振荡 10min，使结晶物充分融解。之后选择 490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光密度值（OD），记录结果，以时间为横坐标，光密度值为纵坐标绘制细胞生长曲线药物。步骤如下：1.2.4.1 细胞分组将细胞分为三组：正常细胞组；空载转染组；目的基因转染组。1.2.4.2 细胞培养人脐带间充质干细胞培养于含青霉素、链霉素（各 1 U/mL，0.1mg/mL）10%FBS 的 DMEM 低糖培养基中，放置在 37℃、5％CO2、相对湿度为 100%的细胞培养箱

病毒,细胞密度,显微镜

MOI值-SD,麦弓长显微镜卜病毒车摹染细胞密度
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R622

【参考文献】