芯片分析鉴定人成骨肉瘤MG63耐药细胞的差异表达基因

发布时间：2020-03-23 01:47

【摘要】：目的:利用基因芯片技术比较分析骨肉瘤耐药细胞与其原代细胞的基因差异表达情况,并验证芯片结果,为开发骨肉瘤的靶向基因治疗奠定基础。方法:1、利用CCK 8法检测人骨肉瘤MG63细胞和耐长春新碱MG63细胞(MG63/VCR细胞)对长春新碱的敏感性。2、采用Trizol法提取两种细胞的总RNA作为样品用于基因芯片检测;利用Affymetrix公司的表达谱芯片配套试剂盒对上述总RNA中的m RNA进行放大、标记和纯化;按照基因芯片杂交、清洗和染色试剂盒,配制杂交反应液与芯片进行杂交、洗涤;通过扫描获得原始数据,芯片结果经过质控处理后筛选出差异表达的基因。3、利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件对芯片结果进行生物信息学分析,预测差异基因在耐药发展中的作用。并通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)对芯片结果的可靠性进行验证。结果:1.对比长春新碱的半数药物抑制浓度IC50,骨肉瘤多药耐药细胞MG63/VCR为493.175±4.473 ng/ml,原代细胞MG63为1.407±0.111 ng/ml(p0.01)。2.芯片结果显示MG63/VCR与MG63细胞之间的差异表达基因达1300条(698条基因表达下调,602条基因表达上调),进一步筛选符合差异倍数|Fold Changes|≥4,且p值0.05有统计学意义为标准的45个下调基因和26个上调基因进行分析。其中转录因子4条,酶12条,转运蛋白5条,跨膜受体4条,其他46条。3.芯片结果利用IPA进行生物信息学分析,预测差异表达基因主要富集在UVA-Induced MAPKSignaling(PIK3R1,MAPK9 and EGFR etc.)、Erb B2-Erb B3 Signaling(RRAS2,STAT5B,and ATM etc.)等信号通路,这些信号通路可能参与调节机体死亡、免疫细胞的死亡和化疗耐药。筛选其中10条基因(ROBO1、DAPK1和AKAP12等),利用q RT-PCR进行验证,证实所选基因在MG63/VCR细胞和MG63细胞中确有差异表达,且90%与基因芯片的表达情况一致。结论:1.骨肉瘤耐药细胞系MG63/VCR与原代细胞系MG63相比,对长春新碱敏感性降低,耐受性增强(p0.01)。2.通过对比分析骨肉瘤耐药细胞与原代细胞之间的基因芯片结果,挖掘了显著差异表达的基因,且差异表达的基因经过验证提示芯片结果是可信的,其中ROBO1、DAPK1、AKAP12等关联基因可能作为骨肉瘤耐药细胞的治疗新靶点。
【图文】：

路线图,实验技术,路线图

以体外培养构建的人成骨肉瘤耐药细胞系 MG63系 MG63 为研究对象，利用 CCK-8 实验验证耐药性差异情况。提取两者细胞的总 RNA 作为基因检后，利用 GeneChip 3’IVT Express Kit 试剂盒d RNA），经过合成一链获得 cDNA，再通过合成板，而后在体外经过反转录得到用生物素标记的、片段处理，与芯片上的探针杂交。完成杂交、扫描图像获得原始数据，最后进行数据分析。（

曲线图表,抑制率,细胞的

图 2.3.1 MG63 和 MG63 / VCR 细胞的抑制率曲线图表。横轴是 lg 药物浓度，纵坐标轴为抑制率。2.3.2 RNA 提取质检结果采用 Trizol 法从骨肉瘤耐药细胞 MG63/VCR 及其原代细胞 MG63中提取总 RNA，将提取的 RNA 用 NanoDrop2000 和 Agilent 2100 进行质量检测，合格样本进入下一步实验。RNA 质控-RIN 值（The RNAIntegrity Number， RIN）可完整的评估样品的质量， The RIN 软件算法考虑到真核生物 RNA 分类，，分数评估为 1-10 分，设定 10 是最完整的，1 是最初级可以保障。结果如表 2.3.2 中显示两组样品的总 RNA 质量符合标准，说明所提取的细胞的总 RNA 具备完整性。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738

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