移植皮肤成纤维细胞治疗糖尿病小鼠创面的实验研究

发布时间：2020-03-23 03:56

【摘要】：[目的]探讨移植皮肤成纤维细胞治疗糖尿病小鼠创面的效果及其可能机制,探讨糖尿病皮肤成纤维细胞离体培养后的活性改变,为今后临床应用皮肤成纤维细胞治疗糖尿病创面奠定基础及提供理论依据。[方法]糖尿病个体模型选用10～12周龄自发基因突变糖尿病小鼠(DB/DB),正常个体模型选用正常小鼠(DB/+),各取20只以组织块培养法提取DMsFb(糖尿病皮肤成纤维细胞)、NsFb(正常皮肤成纤维细胞)。取27只6～8周龄糖尿病小鼠,在其背部复制1cm*1cm全层皮肤缺损,并按随机数字表法分成A、PBS对照组(局部注射PBS于DB/DB小鼠创面四个创缘内);B、DMsFb治疗组(局部注射DMsFb于DB/DB小鼠创面四个创缘内);C、NsFb治疗组(局部注射NsFb于DB/DB小鼠创面四个创缘内);每组9只,分别进行开放创面大小测量、创面换药、图像采集、创面愈合率计算,时间节点取伤后第3、第7、第10、第14、第17天。于伤后第7、14天进行创面取材,免疫荧光法检测创面组织细胞增殖情况(Ki67表达)、免疫组化法检测创面组织新生血管形成率(MVD蛋白表达)、马松染色检测创面组织胶原沉积情况、Annexin-FITC/PI流式细胞术检测离体培养后的DMsFb及NsFb细胞凋亡率、RT-PCR检测离体培养后的细胞TGF-β1、AGEs、MMP-9、NK-1的mRNA表达水平、蛋白质印迹法检测离体培养后的细胞TGF-β1、AGEs、MMP-9、NK-1的蛋白量表达水平,探寻其发生作用的可能机制。对所得数据进行t检验、单因素方差分析。[结果]1)伤后各时相点DMsFb治疗组、NsFb治疗组均较PBS对照组愈合快,但伤后17天NsFb治疗组与PBS对照组比较差异无统计学意义(P0.05);除伤后第3天、第10天外,其余各时相点DMsFb治疗组创面愈合均较NsFb治疗组缓慢(P0.05)。2)伤后7、14天,相较PBS对照组而言,NsFb治疗组及DMsFb治疗组创面的Ki67增殖指数均表达为明显高水平,比较差异有统计学意义(P0.05);而伤后7、14天,NsFb治疗组创面Ki67增殖指数均高于DMsFb治疗组,差异有统计学意义(P0.05);三个组伤后14天创面Ki67增殖指数均较伤后7天增高,差异比较均有统计学意义(P0.01)。3)伤后7、14天NsFb治疗组、DMsFb治疗组创面MVD蛋白表达均高于PBS对照组,比较差异有统计学意义(P0.05);DMsFb治疗组创面MVD蛋白表达低于NsFb治疗组,差异比较有统计学意义(P0.05);三个组较伤后7天创面MVD蛋白表达均低于伤后14天,比较差异均有统计学意义(P0.01)。4)马松染色法结果显示伤后7、14天NsFb治疗组创面胶原沉积量均高于DMsFb治疗组及PBS对照组,比较差异有统计学意义(P0.05);而DMsFb治疗组创面胶原沉积量较PBS对照组稍增,差异比较无统计学意义(P0.05);三个组伤后14天创面胶原沉积量均较伤后7天增高,差异比较均有统计学意义(P0.01)。5)对细胞活性发现,DMsFb细胞凋亡率较NsFb明显增高,相较未经脱离糖尿病环境离体培养的DMsFb P0而言,经离体培养纯化后的DMsFb P4细胞凋亡率尚无明显改善;NsFb P0的TGF-β1及NK-1 mRNA较DMsFb P0呈明显高水平,而DMsFb P4的NK-1 mRNA较DMsFbPO呈下调趋势,差异比较均有统计学意义(P0.05)。NsFbPO的 AGEs 及 MMP-9 mRNA 较 DMsFb 呈明显低表达,而 DMsFb P4 AGEs mRNA则较DMsFb PO显著降低,比较差异均有统计学意义(P0.05);蛋白印迹法显示各组细胞相应蛋白量表达趋势与mRNA表达趋势基本相符。[结论]于糖尿病小鼠创面四个创缘内局部注射NsFb/DMsFb后,较PBS对照组而言,两治疗组创面在愈合进程中的细胞增殖指数(Ki67)、新生血管形成率(MVD蛋白)、胶原沉积等检测指标均有显著改善,同时对NsFb/DMsFb细胞活性检测发现,DMsFb P4 AGEs mRNA较DMsFb P0显著降低,推测可将DMsFb脱离糖尿病这一高糖微环境进行体外培养传代纯化使其细胞功能活性在一定程度上恢复正常,从而在细胞增殖、新生血管形成、胶原沉积、细胞因子介导等方面改善慢性创面愈合进展,在不同时间点上提高糖尿病小鼠的创面愈合率。因此,对糖尿病创面施行局部移植sFb可能早期创面修复进程中起着一定的促进作用,这可为今后临床对慢性创面施行sFb细胞治疗奠定基础,提供理论依据。
【图文】：

＜０．０５）；而伤后各时相点ＤＭｓＦｂ治疗组较ＰＢＳ对照组愈合快，比较差异有统逡逑计学意义（Ｐ＜0．0５）；伤后各时相点ＤＭｓＦｂ治疗组愈合均较ＮｓＦｂ治疗组稍显缓逡逑慢，但仅有伤后７天差异比较有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。见表１，图１、２。逡逑表１糖尿病小鼠创面愈合率（％，ｘ±ｓ）逡逑伤后天数逦Ｎ逦３逦７逦１０逦１４逦１７逡逑ＰＢＳ邋对照组逦９逦５．５９±０．４８逦２４．８０±１．４４逦４９．７１±０．３９逦７９．４２±１．３７逦９４．０１±１．４５逡逑ＤＭｓＦｂ邋治逦９逦９．７８±０．７５逦３８．９６±１．０２逦７７．０３±１．６０逦９５．０５士０．９８逦９７．９９±０．８１逡逑疗组逡逑ＮｓＦｂ邋治疗邋９逦９．８３±０．０８逦４１．７７±０．６３逦７９．１７±０．５４逦９６．９５±１．２２逦９９．３３±０．４５逡逑组逡逑ｔｌ邋值逦９．１５逦１０．２５逦３５．２８逦６．７９逦３．４５逡逑Ｐ１邋值逦０．０１逦０．０１逦０．０１逦０．０２逦０．０７逡逑ｔ２邋值逦０．０６逦４．４１逦１．１４逦４．１６逦１．９２逡逑Ｐ２邋值逦０．９５逦０．０２逦０．３７逦０．０５逦０．２逡逑ｔ３邋值逦８．３７逦１０．６９逦２２．５３逦６．７逦４．４７逡逑Ｐ３邋值逦０．００４逦０．００２逦０．００２逦０．０２２逦０．０４７逡逑注：处理因素主效应Ｆ＝５５４０，邋Ｐ＜０．０１；时间因素主效应Ｆ＝３２７．３，邋Ｐ＜０．０１；两者交互作用逡逑Ｆ＝４３．５８

注：图中标尺每小格＝０．１ｍｍ逡逑图２糖尿病小鼠皮肤全层缺损创面局部注射ＰＢＳ／ＤＭｓＦｂ／ＮｓＦｂ后的创面动态变逡逑化逡逑３．２创面组织Ｋｉ６７的表达情况逡逑各组小鼠创面组织采用免疫荧光法对伤后７、１４天Ｋｉ６７增殖指数情况观察。逡逑每张切片任意取３个高倍视野同时对每个视野阳性细胞数进行计数，按“阳性细逡逑胞率（％）＝阳性细胞数／有核细胞总数＊１00％”所求出的平均数即为每张切片阳逡逑性细胞数。结果如下：逡逑伤后７、１４天，较ＰＢＳ对照组而言，ＮｓＦｂ治疗组创面Ｋｉ６７增殖指数均呈逡逑明显高水平，差异比较有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；伤后７、１４天，ＤＭｓＦｂ治疗逡逑组创面Ｋｉ６７增殖指数均较ＰＢＳ对照组呈明显高水平，比较差异有统计学意义（Ｐ逡逑＜０．０５）；而伤后７、１４天，ＮｓＦｂ治疗组创面Ｋｉ６７增殖指数均较ＤＭｓＦｂ治疗组逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R622

【参考文献】

相关期刊论文 前9条

1 耿梦龙;夏英鹏;杜文君;李辉南;;高糖水平可能通过提高p16基因表达诱导成纤维细胞衰老[J];中华实验外科杂志;2017年11期

2 周日兴;李叶扬;林伟华;李罡;孙敬恩;周旺标;;整合素连接激酶在皮肤创面愈合中的作用及其相关机制研究进展[J];中华烧伤杂志;2017年03期

3 庞若宇;关美萍;郑宗基;薛耀明;;二甲双胍对糖基化终末产物诱导的成纤维细胞凋亡及相关蛋白caspase-3、Bax及Bcl-2表达的影响[J];南方医科大学学报;2015年06期

4 孙梦晗;洪艳;候训尧;马莹娟;申超;罗鼎真;刘雪平;;RAGE阻断剂FPS-ZM1对糖基化终末产物所致大鼠脑部炎症反应的影响及机制[J];中国老年学杂志;2014年10期

5 主父中印;林樾;刘恿铂;蒋亚楠;谭谦;;高葡萄糖高游离脂肪酸对皮肤成纤维细胞β-连环蛋白表达的影响[J];中华实验外科杂志;2014年01期

6 李全;王凌峰;;难愈性创面治疗新进展[J];中华损伤与修复杂志(电子版);2012年04期

7 林炜栋;钱雄;江万里;刘伟伟;陆树良;陈向芳;;糖尿病皮肤病理生理改变及其机制的研究[J];同济大学学报(医学版);2012年02期

8 林刁珠;杨川;陈黎红;任萌;朱平;薛声能;严励;;基质金属蛋白酶9对皮肤成纤维细胞增殖、凋亡和前胶原合成的影响[J];中华医学杂志;2012年08期

9 牛轶雯;谢挺;缪明远;葛奎;陆树良;;糖基化基质对人皮肤成纤维细胞增殖凋亡平衡的研究[J];中国糖尿病杂志;2009年11期

，

本文编号：2596137