MicroRNA124和microRNA21-5p促进间充质干细胞迁移、增殖及向神经分化的体内外研究

发布时间：2020-03-28 00:01

【摘要】：【目的】脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是中枢神经系统损伤中最复杂多变的病理过程之一,其治疗方法一直是研究的热点和难题。研究已证实间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的移植能够促进动物模型中受损脊髓组织的修复,但其功能十分有限。MSCs具有低免疫原性、多向分化潜能及较强的自我更新能力,可用于治疗多种疾病,其功能受多种细胞因子、转录因子、信号通路和micro RNA(mi RNA)的调控。mi R124及mi R21-5p均与神经细胞的功能密切相关。本研究探索mi R124和mi R21-5p在MSCs的迁移、增殖和向神经分化中的作用,并进一步探讨MSCs移植在修复SCI中的作用。【方法】使用全骨髓贴壁培养法从SD大鼠的骨髓中分离、培养MSCs,并在体外扩增至P3-P5代用于进一步实验。将MSCs分为空白对照组(NC-MSCs),并使用Lipofectamine 2000分别将mi RNA-mimics control、mi R124-mimics和mi R21-5p-mimics转染到MSC中,分别定义为转染对照组(MC-MSCs)、mi R124-MSCs组和mi R21-5p-MSCs组。通过细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力。使用含EDU的培养基培养MSCs并通过免疫荧光染色检测各组细胞的增殖能力。使用含β-巯基乙醇诱(Beta-mercaptoethanol,β-ME)及丁基羟基茴香醚(Butylhydroxyanisole,BHA)的诱导分化培养基诱导MSCs向神经细胞方向分化,并通过细胞免疫荧光化学染色方法检测诱导后细胞的神经元标志蛋白TUJ-1及NEUN的表达。使用动脉瘤钳夹法制备大鼠脊髓损伤模型,CM-Dil或EDU体外标记MSCs,通过尾静脉注射或腰椎穿刺的方法移植MSCs进入大鼠体内。取大鼠脊髓组织冰冻切片后进行组织免疫荧光化学染色,观察并检测移植后的细胞数量及向神经分化的情况。【结果】通过全骨髓贴壁培养法可方便获取大量MSCs。通过β-ME和BHA的诱导方法可以在体外成功诱导MSCs向神经细胞方向分化。使用Lipofectamine 2000结合mi R124-mimics或mi R21-5p-mimics,可以获得高表达mi R124或mi R21-5p的MSCs。Mi R124的过表达可以促进MSCs的迁移和向神经细胞方向分化,但对细胞增殖无明显作用。过表达mi R21-5p可以促进MSCs的增殖和向神经细胞方向分化,但对细胞迁移无明显作用。钳夹法制备大鼠脊髓损伤模型具有操作简单、损伤确切、可定量、重复性高、术后模型动物死亡率低的优点。CM-Dil可在体内外有效荧光标记MSCs。通过尾静脉注射及腰椎穿刺注射的方法均可成功移植MSCs进入损伤脊髓处,且腰椎穿刺法移植MSCs可在脊髓损伤处获得更多的移植细胞。同时,移植细胞可分化为GFAP阳性细胞。【结论】通过全骨髓贴壁培养法获取的MSCs可在体外分化为神经元样细胞。mi R124可以提高MSCs的迁移和向神经细胞方向分化的能力。mi R21-5p可以提高MSCs的增殖和向神经细胞方向分化的能力。CM-Dil可在体内外有效荧光标记MSCs。腰椎穿刺法较尾静脉注射法移植MSCs可在脊髓损伤处获得更多的移植细胞,且移植后细胞可成功迁移至脊髓损伤处并向神经组织分化,对于进一步修复脊髓损伤有重要意义。
【图文】：

倒置显微镜,生长情况,光学,细胞

MicroRNA124 和 microRNA21-5p 促进间充质干细胞迁移、增殖及向神经分化的体内外研究第一部分1.2.8 统计学分析：统计学方法：所有数据以平均值±S.E.M 表示，采用 Prime 软件进行统计分析使用 t 检验用于确定不同实验组之间的统计学差异，显著性差异设置为 P <0.05（* <0.05; **P <0.01; ***P <0.001）。1.3 结果1.3.1 MSCs 体外分离及培养接种 3 小时后细胞开始附着于培养皿底。 72 小时后更换培养基后附着的细胞数量增加。培养细胞 5 天，每 48 小时更换一次培养基，大部分细胞呈螺旋状生长的纺锤形，只有少数细胞呈三角形。三次传代后，观察到形态学均一的成纤维细胞样细胞群。即使经过十次传代后，细胞仍保持和第三代细胞一样的呈梭形纤维状的细胞形态大量细胞聚集呈旋涡状生长（图 1）。

方向图,神经细胞,方向,向神经

第一部分 MicroRNA124 和 microRNA21-5p 促进间充质干细胞迁移、增殖及向神经分化的体内外研呈梭形纤维状的细胞形态，大量细胞聚集呈旋涡状生长。(比例尺= 100μm)1.3.2 诱导 MSCs 向神经元样细胞分化使用前文方法中的 1.2.6 的诱导方案诱导 MSCs 细胞向神经细胞方向分化。有不同比例的细胞成功向神经元方向分化，其比例通常超过 46.8％（图 2）。诱导处理小时后，，固定细胞，并对其进行神经元标记物 TUJ-1（图 3）和 NEUN（图 4）染色，确定分化后细胞中神经细胞的比例。大多数诱导后的MSCs表现神经细胞形态，NEU阳性（44.7％±13.2％）和 TUJ-1 阳性（52.7％±12.4％）。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.2

【参考文献】