长链非编码RNA调控七氟醚对大鼠神经干细胞的增殖作用

发布时间：2020-04-07 23:17

【摘要】：孕期及出生后早期动物暴露于全身麻醉药(GA)导致发育期脑神经毒性。迄今,临床上未出现比GA更安全有效的替代药物。因此,如何修复GA介导发育期脑神经毒性是一个迫在眉睫的问题。在脑损伤时,静止期脑神经干细胞(NSC)重新被激活,增殖、分化产生新生神经元修复受损脑区。NSC增殖是内源性修复的关键始动环节。研究GA调节NSC增殖作用对修复GA介导的脑神经毒性具有重要的临床意义。在小鼠大脑室管膜下区、嗅球及齿状回发现大量与神经细胞类型、发育进程、人类疾病相关的特异性长链非编码RNA(lncRNA)。研究表明lncRNA作为竞争性RNA调节灵长类NSC增殖。究竟哪些lncRNA参与调控GA对NSC增殖作用及如何调控?仍一无所知。第一章适宜基因芯片检测的七氟醚暴露NSC模型构建目的:构建适宜基因芯片检测lncRNA表达谱的七氟醚暴露NSC模型。方法:新生大鼠海马来源的NSC原代培养后暴露于七氟醚和对照气体0、3、6、12h,CCK-8检测NSC增殖能力,流式细胞仪检测NSC存活率,琼脂糖电泳和分光光度计检测细胞样品质量。结果:与对照组比较,七氟醚呈暴露浓度和时间依赖性抑制离体培养NSC增殖和存活,2.4%七氟醚暴露6 hNSC细胞样品质量符合基因芯片检测质控要求。结论:暴露于2.4%七氟醚6 h离体培养NSC适宜于基因芯片检测。第二章七氟醚暴露NSC中lncRNA表达谱研究目的:研究七氟醚暴露后NSC中lncRNA差异性表达谱,筛选与NSC增殖相关的目标lncRNA。方法:采用lncRNA基因芯片检测七氟醚暴露NSC中lncRNA表达谱,qPCR验证随机挑选的10个lncRNA和10个mRNA表达水平,经生物信息学分析,筛选并验证MRAK080926和MRAK157758及其邻近基因。结果:qPCR结果与基因芯片表达谱一致,Wnt5a和Gadd45a与NSC增殖相关,上调表达的MRAK080926和MRAK157758分别与邻近基因Wnt5a和Gadd45a呈正相关。结论:MRAK080926和MRAK157758与七氟醚对NSC增殖作用相关。第三章MRAK080926调控七氟醚对NSC增殖作用目的:探讨MRAK080926调控七氟醚对NSC增殖影响,初步研究其调控途径。方法:沉默MRAK080926后采用细胞克隆平板实验、CCK-8及EDU实验检测七氟醚暴露的NSC增殖能力,流式细胞仪和Tunel实验检测NSC存活率,流式细胞仪检测细胞周期和ROS水平,qPCR检测MRAK080926和Wnt5a mRNA表达,Western blot检测Wnt5a、RYK及BAX蛋白表达。结果:沉默MRAK080926后促进七氟醚暴露的NSC增殖,MRAK080926表达和Wnt5a/RYK-ROS信号轴活性也随之下调,促进G0期NSC进入细胞周期,S期延长。结论:沉默MRAK080926挽救七氟醚暴露NSC增殖作用,与抑制Wnt5a/RYK-ROS信号轴和促进NSC再次进入细胞周期相关。总结:七氟醚抑制NSC增殖,lncRNA表达谱存在明显差异,MRAK080926表达明显上调,沉默MRAK080926后抑制Wnt5a/RYK-ROS信号轴,促进NSC增殖。
【图文】：

图１－１原代ＮＳＣ免疫荧光图像逡逑采用巢蛋白（Ｎｅｓｔｉｎ）作为ＮＳＣ标记（红色），ＧＦＡＰ邋（红色）作为星形胶质细胞标、Ｎ（红色）作为神经元标记物染色的ＮＳＣｓ的免疫荧光图像，使用４’６－二脒基－２－苯基吲（ＤＡＰＩ）（蓝色）对核进行复染色。标尺：ｌＯＯｐｍ逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋ＮＳＣ邋ｉｎ邋ｃｕｌｔｕｒｅ．逡逑Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＮＳＣ邋ａｔ邋ｐａｓｓａｇｅ邋３邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ａｎｔｉ－ｎｅｓｔｉｎ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋（ｒｅｄ）邋ａｓ邋ａＮＳＣ邋ｍａｒｋｅｒ，邋ＧＦＡＰ邋（ｒｅｄ），邋ａｓ邋ａｎ邋ａｓｔｒｏｃｙｔｅ邋ｍａｒｋｅｒ，邋ｏｒ邋ＮＳＥ邋（ｒｅｄ），邋ａｓ邋ａ邋ｎｅｕｒｏｎａｌ邋ｍａｒｋｅｒ，邋ｗｉｔｈ逡逑ｎｕｃｌｅｉ邋ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｅｄ邋ｕｓｉｎｇ邋４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ邋（ＤＡＰ１）邋（ｂｌｕｅ）．邋Ｂａｒ：邋１００邋ｊａｍ．逡逑２七氟醚抑制ＮＳＣ增殖逡逑为了探讨七氟醚暴露浓度和时间诱导ＮＳＣ增殖变化的趋势，我们采用胞毒性较低的ＣＣＫ－８实验检测细胞ＯＤ４５0ｎｍ，通过细胞活性间接反映Ｎ殖情况。不同浓度的七氟醚或不同暴露时间对细胞增殖影响不同，差异具

逑无此效应。由此可见，七氟醚呈暴露浓度和暴露时间依赖性介导ＮＳＣ增殖受逡逑抑制（图１－２）。逡逑＾逦－ａ－邋ＮＳＣｓ＋１，２％ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ逡逑Ｉ１１０］逦ＮＳＣｓ＋２．４％ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ逡逑！邋１００－逦．逦ＮＳＣｓ＋３．６％ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ逡逑ｉ邋８。逡逑Ｉ７０－逡逑＝ｓ邋６０－Ｉ逦．逦．逦．逡逑ｕ邋０逦５逦１０逦１５逡逑ｄｕｒａｔｉｏｎ逡逑图１－２邋ＣＣＫ８检测不同浓度七氟醚暴露不同时间对ＮＳＣ增殖的影响逡逑＊表示与对照组相比：户＜0．0５；逦＃表示与暴露６ｈ相比：尸＜０．０５逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｉｍｅ－ｍａｎｎｅｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ逡逑ａｎｄ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ＮＳＣ．逡逑＊：ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，尸＜０．０５．邋＃：邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ邋ｅｘｐｏｓｕｒｅ邋ｆｏｒ邋６邋ｈ逡逑２．３七氟醚暴露后ＮＳＣ存活逡逑为建立适宜基因芯片检测的ＮＳＣ模型，筛选七氟醚暴露浓度和时间。结合逡逑ＣＣＫ－８实验结果和文献报道［５］，选择１邋ＭＡＣ邋（２．４％）七氟醚探讨不同暴露时间逡逑对ＮＳＣ存活的影响。２．４％七氟醚抑制ＮＳＣ存活，不同暴露时间抑制ＮＳＣ存活逡逑率差异具有统计学意义0Ｐ＝0．000），随着七氟醚暴露时间延长，细胞凋亡和坏死逡逑逐渐增多
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614

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本文编号：2618522