氧浓度对人髓核间充质干细胞生物学特性影响

发布时间：2020-04-13 07:01

【摘要】：背景椎间盘退变是腰痛的主要病因,据统计在人群中有较高患病率,严重情况下会导致残疾,给患者带来沉重的社会经济负担。椎间盘是人体最大的无血管组织,由髓核,纤维环和软骨终板组成。椎间盘内氧浓度范围为(1%O_(2-)5%O_2),在椎间盘退变后可能使得氧浓度范围变得更低。干细胞存在于退变的髓核内,仍具有再生、分化能力等。然而在椎间盘退变的过程中内源性髓核间充质干细胞(nucleus pulposusmesenchymal stem cells,NPMSCs)为何保存“静默”状态,不向类髓核细胞分化修复退变组织,仍需深入研究。目的分离培养髓核来源的间充质干细胞,比较不同氧浓度下细胞的生物学特性(形态、干性、增殖能力、线粒体等相关基因的表达),探索氧浓度对椎间盘退变机制的影响。方法用胶原酶消化法从腰椎骨折(外伤性)及先天性脊柱侧凸矫形患者手术摘除的4个腰椎间盘(Pfirrmann椎间盘退变分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离细胞,体外培养,传代,观察记录细胞形态。取P3代细胞,用流式细胞仪对分离得到的细胞表面抗原CD90、CD73、CD105、CD44和CD31、CD34、CD45的表达情况进行检测;用成骨、成脂A、成脂B、成软骨培养液诱导培养细胞,分别在21d、28d、21d用茜素红、油红O、甲苯胺蓝对细胞进行染色,观察其成骨、成脂、成软骨能力。基于国际干细胞治疗协会(ISCT)有关间充质干细胞(MSCs)的判定标准,对本实验得到的细胞进行综合评估鉴定。在三气培养箱的低氧条件(2%O_2、5%CO_2、37°C),常规细胞培养箱的常氧条件(20%O_2、5%CO_2、37°C)下培养P3代细胞。通过细胞计数计算各时间点(1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d)细胞的数量,比较不同氧浓度的生长曲线。使用Architect c8000自动生化检测仪检测各时间点(1d、2d、3d、4d、5d)培养基的PH值、渗透压。实时荧光定量(qRT-PCR)检测不同氧浓度培养下细胞的干性基因POU5F1(OCT4)、NANOG、SOX2及扩增基因CCND1(CyclinD1)、MYC(c-Myc)、低氧诱导基因EPAS1(HIF1α)、能量基因ATP5A1、线粒体相关基因COX4I1、TFAM、MT-CO_(1、)MT-CO_2的mRNA表达情况。结果髓核来源的间充质干细胞呈典型的单层贴壁生长,纺锤样。P3代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记高表达CD90(80.4%)、CD73(99.9%)、CD105(99.8%)、CD44(95.9%),低表达CD31(5.3%)、CD34(4.4%)、CD45(6.8%)。茜素红、油红O染色、甲苯胺蓝染色证实可向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化。根据ISCT有关MSCs的判定标准,分离培养的细胞即NPMSCs。低氧环境下细胞形态更小,形态更接近原始间充质干细胞。细胞增殖更快,有统计学意义(P0.05),低氧时倍增期为31.22±1.98 h,常氧时倍增期为39.56±2.02 h。不同氧浓度各时间点培养基的PH值、渗透压差异无统计学意义(P0.05),且皆处于适于细胞生成的范围。低氧培养细胞干性基因POU5F1(OCT4)、NANOG、SOX2较常氧培养显著升高(P0.05);扩增基因CCND1(CyclinD1)、MYC(c-Myc)较常氧显著升高(P0.05);低氧诱导因子HIF1α相关基因EPAS1显著升高(P0.05);核编码的能量基因ATP5A1(三磷酸腺苷合成酶)低氧时显著升高(P0.05);核编码的与线粒体合成等功能有关基因COX4I1(细胞色素c氧化酶IV亚基1型同工酶)、TFAM(线粒体转录因子A)低氧时明显降低(P0.05);线粒体编码的与自身生成、合成功能相关基因MT-CO_1(线粒体编码细胞色素c氧化酶I)、MT-CO_2(线粒体编码细胞色素c氧化酶II)低氧时明显降低(P0.05)。结论低氧环境下人NPMSCs的形态更小、扩增能力更强、PH值、渗透压无明显影响,但促进干性、扩增、低氧诱导基因及合成能量基因的表达,抑制线粒体合成功能相关基因的表达。
【图文】：

细胞形态,细胞,间充质干细胞,髓核

均一的短纺锤形，而 P1 代细胞大小较 P0显提早，约 5-7d 细胞即可融合至传代，致，为纺锤样梭形，一般约 3-4 天细胞即消化传代。由于 P3 代细胞形态大小、增可满足使用，故本实验选取 P3 代细胞进

间充质干细胞,流式,髓核,造血干细胞

图 1：正常髓核间充质干细胞（NPMSCs）:光镜下 P3 代细胞，细胞形态均一，，呈纺锤样梭形（×4）。Figure 1: The third passage cultured NPMSCs from non -degenerative nucleuspulposus generally grew into typical, adherent monolayer cells,with a fibroblast-likeappearance（×4）。2.2 表面抗原表达使用流式细胞仪检测成功分离的人髓核间充质干细胞，结果显示细胞表面标志，高表达 CD90(80.4%)、CD73(99.9%)、CD105(99.8%)、CD44（95.9%），低表达造血干细胞标志 CD31(5.3%)、CD34(4.4%)、CD45（6.8%）（图 2）。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5

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