慢性不可预知性应激对椎间盘退变的作用机制研究

发布时间：2020-04-30 16:42

【摘要】：目的:探讨慢性不可预知性应激对椎间盘退变的影响以及积极应对慢性应激状态对椎间盘再生的作用机制。方法:第一部分:64只Wistar大鼠随机分为两组,即正常对照组(NC group)和慢性不可预知性应激模型组(CUS group),每组32只。采用10种不同的刺激作为应激原,不可预知性刺激21天建立CUS模型,评价大鼠行为改变特。用27G穿刺针以经皮椎间盘中心穿刺法对两组大鼠Co7-8椎间盘进行穿刺,次日起对CUS模型组继续进行刺激。穿刺后分别在0、2、4、8周时(每时间点8只/组),采用MRI检查,改良Pfirrmann分级评分;组织切片HE染色,Han等的椎间盘退变组织学评分的方法对两组大鼠穿刺椎间盘的退变程度进行比较,初步探讨慢性应激对椎间盘退变的作用;第二部分:32只Wistar大鼠随机分为两组,即NC组和CUS模型组,每组16只。CUS模型建立后分别在0周和8周时,首先采用MRI、HE染色等方法评价单纯慢性不可预知性应激刺激是否引起椎间盘的退变。随后采用实时荧光定量q PCR和免疫组化对髓核组织中蛋白多糖(Aggrecan)、II型胶原蛋白、基质金属蛋白酶-1和-3(MMP-1、MMP-3)的m RNA和蛋白水平的表达进行检测,采用TUNEL法检测髓核细胞凋亡率,免疫组化测髓核IL-1β的表达。与NC组进行比较,探讨慢性应激对椎间盘退变的影响及作用机制;第三部分:24只Wistar大鼠随机分为两组,即NC组8只和CUS模型组16只,后者再分为模型组和积极应对组,每组8只。采用HE染色评估椎间盘的退变程度,TUNEL法检测髓核细胞凋亡率,Western-blot检测髓核TGF-β1、IL-1β、NF-κB(p-IκB、P65)的表达。组间比较,探讨积极应对慢性应激对椎间盘再生的作用及其机制。结果:第一部分:造模21天后大鼠行为表现符合CUS模型的评价标准。慢性应激起始阶段(0周时),两组穿刺椎间盘的MRI和HE染色的表现相似并正常,改良Pfirrmann分级和组织学评分均无明显统计差异(p?0.05)。2周时,单穿纤维环穿刺组表现轻度影像学和组织学上的退变,而CUS载体纤维环穿刺组达到中度椎间盘退变,平均Pfirrmann分级和组织学评分明显高于单纯纤维环穿刺组(p0.05)。4周时,MRI检查显示,单纯纤维环穿刺组Pfirrmann分级主要为2-3级,CUS载体纤维环穿刺组为3-4级。组织学检查显示,单纯纤维环穿刺组的椎间盘表现为中度退边,而CUS载体纤维环穿刺组椎间盘达到重度退变。两组Pfirrmann分级和组织学评分均有明显统计差异(p0.05)。8周时,两组穿刺椎间盘在影像和组织学上均呈现严重退变表现,但CUS载体纤维环穿刺组的平均Pfirrmann分级和组织学评分仍高于单纯纤维环穿刺组(p0.05);第二部分:MRI检查和HE染色结果显示,在慢性应激起始点(0周时),椎间盘无明显影像学和组织学退变迹象,与NC比较平均组织学评分无明显统计学差异(p?0.05)。8周时,CUS模型呈现髓核面积缩小、水分丢失等影像学的退变。HE染色示髓核细胞数量减少,体积缩小、呈类软骨样细胞,髓核纤维化、结构紊乱。两组平均组织学评分有明显统计学差异(p0.05)。PCR结果显示,0周时两组Aggrecan、II型胶原蛋白的m RNA表达水平较高、MMP-1、MMP-3的m RNA表达水平较低,每个指标组间比较无明显统计差异(p?0.05)。8周时,CUS模型组髓核中Aggrecan、II型胶原蛋白的m RNA表达水平明显降低,而MMP-1、MMP-3的m RNA水平升高,与NC组比较有明显统计学差异(p0.05)。TUNEL染色示,8周时CUS模型组的髓核细胞凋亡率明显升高,与NC组比较有明显统计学差异(p0.05)。免疫组化示,0周时两组髓核组织Aggrecan、II型胶原蛋白的表达均较高,MMP-1、MMP-3及IL-1β阳性细胞数比例较低,两组无明显差异(p?0.05)。8周时,CUS组的Aggrecan和II型胶原蛋白的表达明显降低,MMP-1、MMP-3、IL-1β阳性细胞数比例显著升高,与NC组比较有明显统计学差异(p0.05);第三部分:HE染色,CUS模型组呈现明显的组织学上的退变,而积极应对组的椎间盘退变不明显,平均组织学评分与模型组比较,有明显差异(p0.05),与NC组比较无明显差异(p?0.05)。TUNEL染色,模型组髓核细胞凋亡率明显升高,与NC有明显差异(p0.05)。积极应对组髓核细胞凋亡率虽然与NC组比较有明显统计学差异(p0.05),但与模型组比较细胞凋亡明显减少(p0.05)。Western-blot检测结果显示,模型组髓核中NF-κB、IL-1β的表达升高,TGF-β1表达降低,积极应对组中NF-κB和IL-1β的表达量明显降低,TGF-β1表达量升高。积极应对组TGF-β1、NF-κB、IL-1β的灰度比值与模型组比较有明显统计学差异(p0.05)。结论:第一部分,慢性不可预知性应激刺激能够促进纤维环穿刺诱导的椎间盘退变的进展;第二部分,慢性应激在早期阶段对椎间盘不产生明显的影响,髓核处于正常代谢状态,炎症因子的表达较低。随着时间的延长,慢性应激状态在髓核中促进炎症因子和基质降解酶的表达,加速髓核细胞的凋亡及细胞外基质的分解,抑制Aggrecan、II型胶原等主要基质蛋白的合成,从而降低髓核细胞外基质的含量,使椎间盘的组织形态逐渐发生改变,进而导致椎间盘的退变;第三部分,积极应对慢性应激状态通过促进TGF-β1的表达,抑制NF-κB通路的途径,降低髓核细胞的凋亡,增强细胞的代谢活性,从而能够促进椎间盘的再生。
【图文】：

技术路线图,强迫游泳,足底,电刺激

1.2.2 技术路线图1.2.3 慢性不可预知性应激模型的建立采用如下 10 种刺激作为应激原，每天随机抽取 1-2 种作用于大鼠，使之无法预知何种刺激将要发生，，并且同种刺激不连续出现。（1）高速水平震荡：第 1 周，按照 120 次/min，持续 45min；第 2 周，应激持续 60min；第 3 周，应激持续 90min。（2）足底电刺激：第 1 周，电压 35V

尾椎,大鼠

15图 2 大鼠尾椎间盘解剖位置Fig.2 The anatomical position of rat tail intervertebral discs
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5

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