细胞外基质粘附性和力学强度对骨肉瘤生长微环境影响及其机制研究

发布时间：2020-04-30 18:43

【摘要】：目的和意义:骨肉瘤是骨科疾病中恶性程度高,致死率也较高的肿瘤之一,目前其发生和发展的机制尚未明。细胞外基质在组织中可以构成复杂的网架结构,支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动甚至掌控着细胞(包括正常细胞和肿瘤细胞)的命运。然而,对于正常细胞和肿瘤细胞,他们对于ECM性质的依赖程度却有所不同。本研究旨在通过研究细胞外基质对骨肉瘤细胞生长微环境的调控来探索骨肉瘤发生和发展的机制,并用成骨细胞作为对照进一步探索肿瘤细胞和正常细胞生长微环境的不同。方法:我们选取骨肉瘤细胞和成骨细胞作为本文的研究对象。首先用四种常用的天然支架材料(胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖)分别在二维和三维条件下培养骨肉瘤细胞和成骨细胞的生长情况。然后用活/死细胞染色检测他们的细胞活力,用PCR检测骨肉瘤细胞和成骨细胞的特征性因子,用ELISA的方法检测成骨细胞碱性磷酸酶的分泌量,用western blot的方法检测骨肉瘤特异性蛋白的表达,用免疫荧光染色分别检测骨肉瘤细胞和成骨细胞的特异性蛋白的表达。然后将骨肉瘤细胞分别和四种天然材料(胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖)混合后接种于裸鼠的皮下,并观察他们的成瘤情况,包括肿瘤形成的体积、血管生成的情况和组织学表现等等。接着通过以上检测分析骨肉瘤细胞和成骨细胞在四种天然材料(胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖)中的行为学,并分析这些行为与四种天然材料(胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖)理化性质(孔隙大小、力学强度、粘附性和膨胀率等)差异的关系。接着我们用甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)制备了9种不同粘附度和强度的PEGDA/GelMA生物支架,并研究其性能。基丙烯酸酯明胶由明胶和甲基丙烯酸酐制备而成,通过核磁共振氢谱的方法来表征甲基丙烯酸酯明胶,并用购买的明胶作对比,观察其成分。用扫描电镜观察9种不同粘附度和强度的PEGDA/GelMA水凝胶表面结构和孔隙,同时检测其溶胀率、透过率,粘附性和力学强度。然后将骨肉瘤细胞和成骨细胞培养于二维的PEGDA/GelMA水凝胶表面和三维的PEGDA/GelMA水凝胶支架中,并检测他们的粘附、增殖和生长情况。最后分别用Focal adhesion通路抑制剂干预三维PEGDA/GelMA水凝胶支架中的骨肉瘤细胞,用Adherens Junction通路抑制剂干预三维PEGDA/GelMA水凝胶支架中的成骨细胞,并检测他们的相关功能分子的增长状况。结果:当骨肉瘤细胞二维培养在四种天然支架材料(胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖)上时,其活力表现出如下趋势:胶原基质胶海藻酸钠琼脂糖。同时,其特征性基因(缺氧诱导因子α(HIFA)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9))的表达,以及特征性蛋白(抗层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和CD133)的表达也展现出如上趋势。类似的,当成骨细胞二维培养在四种天然支架材料(胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖)上时,其活力、特征性基因(碱性磷酸酶(ALP)、一型胶原(COL1)、骨形成蛋白(BMP2)和矮小相关转录因子2(RUNX2))的mRNA水平,碱性磷酸酶(ALP)的分泌量还有骨钙素(OCN)的免疫荧光染色都表现出如下趋势:胶原基质胶海藻酸钠琼脂糖。但是,当骨肉瘤细胞三维培养在四种天然支架材料(胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖)中时,其活力、特征性基因和蛋白的表达水平却与二维培养时完全不同,其趋势为:胶原琼脂糖基质胶海藻酸钠。与之相反的是,当成骨细胞三维培养在四种天然支架材料(胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖)上时,其活力、特征性基因和蛋白的表达趋势仍与其在二维培养中相一致。裸鼠成瘤实验的结果与骨肉瘤细胞在三维培养时的结果相一致,生长在胶原水凝胶中的骨肉瘤细胞其形成的肿瘤体积最大,新生成的血管最多,侵袭性最强,然后依次是琼脂糖、基质胶和海藻酸钠。四种天然支架材料(胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖)的理化性质各有不同,主要体现在粘附性和力学强度上。粘附性从强到弱为:胶原基质胶海藻酸钠琼脂糖。力学强度从大到小为:胶原琼脂糖基质胶海藻酸钠。我们猜想骨肉瘤细胞的行为与细胞外基质的力学强度有关,成骨细胞则与细胞外基质的粘附性有关。我们成功应用甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)构建了9种不同粘附度和强度的PEGDA/GelMA水凝胶,结果显示,甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)主要调控的是水凝胶的粘附性,而聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)主要调控的是水凝胶的力学强度。在二维培养时,骨肉瘤细胞和成骨细胞的行为学表现相一致。对于骨肉瘤细胞,其活力、特征性基因(HIF、VEGF、MMP2和MMP9)的MMP2和MMP9的免疫荧光染色都表明,随着支架上粘附分子的增加而骨肉瘤细胞生长得更好。类似的,人成骨细胞,其活力、特征性基因(ALP、COL1、BMP2和RUNX2)的mRNA水平随着支架上粘附分子的增加而显现出更强的表达趋势,同时OCN和ALP的免疫荧光染色也说明了成骨细胞依赖于粘附分子而生长。不同的是,在三维(3D)培养条件下,骨肉瘤细胞和成骨细胞的增殖和生长则表现出截然不同的趋势。三维培养的人骨肉瘤细胞不论是增殖还是其特征性基因(HIF、VEGF、MMP2和MMP9)的表达都随着支架材料的力学强度(刚度)的增加而增强,而且标志着肿瘤恶性程度的乙醛脱氢酶(ALDH)和CD133分子也随着支架材料的力学强度(刚度)的增加而表现出增高的趋势。与之相反的是,三维培养的人成骨细胞并不受支架材料的力学强度(刚度)的影响。在三维培养条件下,人成骨细胞不论是增殖还是其特征性基因(ALP、COL1、BMP2和RUNX2)的表达都随着支架材料中的粘附分子的增加而增加,且成骨细胞分泌的骨钙素(OCN)和钙盐都相应增加。抑制Focal Adhesion通路后,三维培养的骨肉瘤细胞的生长不受材料力学强度的影响,抑制Adherens Junction通路后,三维培养的成骨细胞的生长不受材料粘附性的影响。结论:甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)可以用于构建不同粘附度和强度的PEGDA/GelMA水凝胶系统。骨肉瘤细胞的生长依赖于细胞外基质的力学强度,而这种依赖性是通过Focal Adhesion通路介导的。而细胞外基质的粘附性则是通过Adherens Junction通路调控成骨细胞的生长。
【图文】：

图 1-1 在四种天然材料（胶原、基质胶、海藻酸钠和琼脂糖）的二维2D）培养条件下骨肉瘤细胞和成骨细胞的活力（绿色为活细胞，红色死细胞），标尺：300μm。为了进一步探究两种细胞在这四种材料的二维培养条件下的生长状们用 pcr 的方法分别检查两种细胞特征性的基因。如图 1-2 所示，在（2D）培养7天时，骨肉瘤（MG63）的特征性基因：缺氧诱导因子α（HIFA）管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶 2（MMP2）和基质金属蛋 9（MMP9）的表达量均表现出如下趋势：胶原>基质胶>海藻酸钠>琼

（2D）培养条件下骨肉瘤细胞和成骨细胞的活力（绿色为活细胞，红色死细胞），标尺：300μm。为了进一步探究两种细胞在这四种材料的二维培养条件下的生长状我们用 pcr 的方法分别检查两种细胞特征性的基因。如图 1-2 所示，在维（2D）培养7天时，骨肉瘤（MG63）的特征性基因：缺氧诱导因子α（HIFA血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶 2（MMP2）和基质金属蛋酶 9（MMP9）的表达量均表现出如下趋势：胶原>基质胶>海藻酸钠>琼糖，，与细胞活力相一致。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738

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本文编号：2646067