成年大鼠脊髓中央管膜下神经干细胞的提取及重组人促红细胞生成素对其体外培养增殖、凋亡的影响

发布时间：2020-05-10 07:00

【摘要】：脊髓损伤目前临床上仍缺乏有效的治疗手段,其伤后神经功能修复问题也是世界性难题,而利用外源性细胞移植替换脊髓中受损的神经细胞有望成为治愈脊髓损伤的治疗方式。成年个体脊髓中央管膜下来源的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)作为移植细胞来源治疗脊髓损伤时,具备低成瘤性、低免疫排斥反应、无伦理道德问题等优势。但是,细胞移植治疗脊髓损伤时,常常存在移植细胞数量不足、移植区域细胞存活率低等问题。由此可见,如何促进或提高体外培养神经干细胞的生长、增殖及生存率,对于形成足够神经干细胞数量用于移植治疗脊髓损伤是至关重要的。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的神经保护作用近年来得到广泛关注,有学者发现EPO在体外对于非成年脊髓来源神经干细胞具有一定的促进增殖及抗凋亡作用。若EPO也能促进体外培养的成年个体脊髓中央管膜下神经干细胞生长、生存,对于下一步进行移植治疗将大有裨益。然而,国内外有关EPO对于体外培养成年个体脊髓中央管膜下神经干细胞影响的研究鲜有报道,EPO处理的适宜剂量、适宜时间及相关机制也尚无定论。本课题首先成功从成年大鼠脊髓中央管膜下分离出神经干细胞,进而发现5U/ml和20U/ml的浓度和96h的处理时间可能是发挥EPO的促增殖、抗凋亡及调节细胞周期作用的适宜浓度和处理时间,最后初步探讨EPO影响成年大鼠脊髓中央管膜下神经干细胞增殖、凋亡的作用机制。主要方法:1.依据前人的方法从成年大鼠脊髓中央管膜下提取出神经干细胞,并利用细胞免疫荧光染色进行鉴定。2.用CCK8检测初步筛选EPO影响成年大鼠脊髓中央管膜下神经干细胞的适宜浓度和处理时间,并通过神经球计算、细胞计数对适宜浓度和处理时间进行佐证。3.继续利用EdU检测、TUNEL检测及流式细胞周期验证适宜浓度EPO在适宜处理时间影响成年大鼠脊髓中央管膜下神经干细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响,最后通过荧光定量PCR检测相关基因表达的变化。4.采用SPSS20.0软件(IBM公司)对数据进行处理,实验结果计量以均数±标准差(X ±SD)或均数X表示。组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),若方差齐用LSD检验、方差不齐则用Dunnett T3检验作两两比较,当P0.05为差异具有统计学意义。结果:本实验成功从成年大鼠脊髓中央管膜下提取出神经干细胞,CCK8检测筛选出5U/ml、20U/ml浓度的EPO可能为影响成年大鼠脊髓中央管膜下神经干细胞增殖的适宜浓度,而适宜的处理时间可能为96h。随后,通过神经球计算、细胞计数、EdU检测、流式细胞周期检测的结果也进一步验证了 CCK8结果;TUNEL检测也证实了适宜浓度及处理时间的EPO可以下调神经干细胞的细胞凋亡。最后,PCR检测结果也证明了适宜浓度及处理时间的EPO可以上调抗凋亡、细胞周期调节相关基因。结论:5U/ml、20U/ml浓度的EPO可能为体外促进成年大鼠脊髓中央管膜下神经干细胞增殖、抗凋亡、细胞周期调节的适宜浓度,而适宜的处理时间可能为96h。
【图文】：

硕士学位论文逡逑球（图２Ａ）。原代神经干细胞传代后培养箱内继续培养１周，神经干细胞可聚逡逑集形成规则圆形、直径约为ｌＯＯｕｍ的神经球（图２Ｂ）。逡逑图２．倒置相差显微镜下观察成年大鼠脊髓神经干细胞生长情况逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．Ｔｈｅ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｄｕｌｔ邋ｒａｔ邋ｓｐｉｎａｌ邋ｃｏｒｄ邋ｎｅｕｒａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ逡逑图Ａ示原代成年大鼠脊髓中央管膜下神经干细胞培养一周后形成大小不一神经球；图Ｂ示逡逑原代神经干细胞传代后培养一周形成规则圆形、直径约为ｌＯＯｕｍ的神经球。逡逑Ａ．Ｎｅｕｒａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ａｄｕｌｔ邋ｒａｔ邋ｓｐｉｎａｌ邋ｃｏｒｄ邋ｃａｎ邋ｆｏｒｍ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｉｚｅｓ邋ｏｆ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ逡逑ａｆｔｅｒ邋ａ邋ｗｅｅｋ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｕｌｔｕｒｅ；邋Ｂ．Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｎｅｕｒａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ｃｏｕｌｄ邋ｆｏｒｍ邋ａ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ邋ｏｆ邋ｒｅｇｕｌａｒ逡逑ｃｉｒｃｌｅ邋ａｎｄ邋ａ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ邋ａｂｏｕｔ邋ｌＯＯｕｍ邋ａｆｔｅｒ邋ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｆｏｒ邋ａ邋ｗｅｅｋ．逡逑１．２．３免疫荧光染色鉴定结果逡逑体外培养的成年ＳＤ大鼠脊髓中央管膜下神经干细胞行Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２免疫逡逑荧光染色，，发现培养的神经干细胞可以稳定表达神经前体细胞标志蛋白Ｎｅｓｔｉｎ逡逑（图３Ａ）及干细胞转录因子Ｓｏｘ２邋（图３Ｂ）。免疫荧光染色同时，用Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑进行核染色标记（图３Ｃ）。拍照后将Ｎｅｓｔｉｎ

体外培养的成年ＳＤ大鼠脊髓中央管膜下神经干细胞行Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２免疫逡逑荧光染色，发现培养的神经干细胞可以稳定表达神经前体细胞标志蛋白Ｎｅｓｔｉｎ逡逑（图３Ａ）及干细胞转录因子Ｓｏｘ２邋（图３Ｂ）。免疫荧光染色同时，用Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑进行核染色标记（图３Ｃ）。拍照后将Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２邋（图３Ｄ）、Ｎｅｓｔｉｎ和Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑（图３Ｅ）的图片进行融合。逡逑１３逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.2

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本文编号：2656929