肝前体细胞的3D培养、分化及移植研究

发布时间：2020-05-13 10:11

【摘要】：目的:肝移植是晚期肝病唯一有效的治疗方法。然而,目前在全球范围内供体器官的短缺意味着许多患者会死于等待不到合适的器官。因此,迫切需要探索晚期肝病的新型治疗方案。最近,肝干细胞与前体细胞治疗作为肝病的一种治疗方案为该疾病的治疗带来了新希望,而成人肝脏中的肝脏前体细胞(HPCs)由于其可能具有再生肝细胞的能力而有望成为治疗肝脏疾病的重要来源。已有研究证实干细胞的标志物性别决定基因9(SOX9)和胆管细胞标志物细胞角蛋白7(CK7)可用于鉴定成年小鼠中胆管来源的HPCs群。然而,如何分离HPCs并进行高效率扩增仍然是影响其深入研究以及最终进入临床试验的关键问题。本研究,我们希望能建立一种简单、高效的肝前体细胞分离培养方法,能从健康成年小鼠的肝脏中分离出HPCs进行体外克隆扩增以获得大量且性状稳定的HPCs,并研究扩增所得的HPCs在体内外环境的分化能力。此外,我们将初步探讨HPCs移植至小鼠损伤肝脏后的定植、分化情况。研究显示,TGF-β在肝损伤和肝纤维化过程发挥重要作用,最后我们将初步探讨TGF-β对HPCs增殖分化的影响。方法:将6-8周健康小鼠的肝脏灌注去红细胞,采用文献报道中肺干细胞分离培养方法进行微小调整后分离提取小鼠肝组织内的前体细胞,然后从形成克隆的前体细胞中挑单个克隆进行传代,扩增得到大量的、稳定的细胞群。采用免疫荧光染色技术对扩增后的前体细胞进行鉴定,分别用干细胞标记蛋白SOX9、胆管细胞的标记蛋白CK7、成熟肝细胞的标记蛋白(HNF4α)和白蛋白(Alb)来验证本研究所分离提取的前体细胞为HPCs(CK7+ SOX9 + HNF4α-Alb-)。采用体外3D培养技术对提取的HPCs进行进一步培养,在培养第14天后对其形成的结构进行检测,通过免疫荧光染色检测成熟肝细胞标记HNF4α和Alb以研究HPCs在3D培养中的分化情况。同时观察成纤维细胞生长因子9(FGF9)和肝脏细胞生长因子(HGF)在3D环境中对HPCs分化的影响。采用肾包膜下细胞注射技术观察分离提取的HPCs在体内分化情况。在注射后第14天后取材对HPCs在肾包膜下形成的结构进行检测,同样通过免疫荧光染色检测成熟肝细胞标记HNF4α和Alb以研究在体内HPCs的分化情况。同时观察成纤维细胞生长因子9(FGF9)和肝脏细胞生长因子(HGF),在体内环境中对HPCs分化的影响。通过腹腔内注射CCL4建立小鼠肝损伤模型。然后采用开腹经脾脏注射的方式进行HPCs的肝脏移植,并观察HPCs在小鼠损伤肝脏中的定植以及定植后的分化情况。为初步探讨TGF-β在HPCs增殖和分化中的作用,我们采用TGF-β与其抑制剂SB431542处理HPCs,通过MTT实验检测各组处理后HPCs的细胞活性,同时采用定量PCR技术观察TGF-β对HPCs CK7、SOX9、HNF4α和Alb转录水平的影响。结果:本研究成功的从健康成年小鼠肝脏组织中分离提取获得形态、大小均一、并能稳定的传代和扩增的前体细胞克隆。进一步鉴定发现我们提取的前体细胞同时表达CK7和SOX9,不表达HNF4α和Alb,且具有较强的扩增能力,提示本研究所提取的前体细胞为HPCs。此外,该群细胞可在体外进行大量、稳定的克隆性扩增,并在不分化的状态下进行大量克隆性扩增,即表现出干细胞的增殖特性。发现该群HPCs能在3D培养环境中自发聚集形成类球样结构,并在球体内形成亚结构。检测发现该类球样结构内的部分HPCs表达成熟肝细胞的标记蛋白HNF4α和Alb,提示HPCs在3D培养环境中可向肝细胞方向分化。在使用FGF9和HGF处理后,与未处理组相比,表达HNF4α和Alb的HPCs细胞数明显增多。在肾包膜下诱导HPCs体内分化的实验中,我们发现HPCs也可自发形成囊状结构,也可表达HNF4α和Alb,形成的结构大小不一,但均比体外3D培养环境中所获球体大。此外,在FGF9和HGF处理后,表达HNF4α和Alb的HPCs细胞数明显增多。采用CCl4腹腔注射成功构建小鼠肝损伤模型,并通过经脾脏注射的方式将体外克隆性扩增的HPCs移植至小鼠损伤肝脏,并在移植后第7天和第14天都检测到HPCs在小鼠损伤肝脏中定植,且部分定植HPCs发生分化。发现TGF-β对提取HPCs的克隆性生长具有抑制作用,且在TGF-β处理后,HPCs形态发生了改变,由类圆形变成梭状。TGF-β处理后HPCs的相关标志CK7和SOX9转录水平增高,HNF4α和Alb转录水平降低,提示TGF-β可影响HPCs的分化。此外,在使用TGF-β抑制剂SB431542后TGF-β对HPCs的影响消失。结论:本研究在证实健康成年小鼠肝脏内存在具有干细胞特性的HPCs后,对文献中报道的肺干细胞分离提取方法进行微小调整后成功从小鼠肝脏中分离出前体细胞且证实该群细胞是胆管来源的细胞,在体外具有较强的扩增能力,并在体内体外均具有向肝细胞分化的能力。该细胞群在体内体外均具有自发聚集成球的特点,且在体内体外形成的类球结构有利于HPCs向成熟肝细胞分化。此外,本研究证实体外扩增的HPCs可在小鼠损伤肝脏中定植并且具有向肝细胞分化的能力。最后,本研究证实了 TGF-β在HPCs增殖和分化中的抑制作用。本研究为HPCs与肝脏再生之间的关系研究提供了有力的支持,同时也为肝病的细胞治疗研究提供了新思路。
【图文】：

逑物逡逑图１－１成年小鼠肝脏门静脉附近存在胆管细胞标志物ＣＫ７邋（红色）和前体细胞标志逡逑物ＳＯＸ９邋（绿色）共表达的细胞（４０0ｘ邋）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｂｉｌｉａｒｙ邋ｍａｒｋｅｒ邋ＣＫ７（ｒｅｄ）邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ邋ｃｅｌｌ逡逑ｍａｋｅｒＳＯＸ９（ｇｒｅｅｎ）邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ａｄｕ

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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R657.3

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本文编号：2661795