血管生成素2调控椎间盘退行性改变的机制研究

发布时间：2020-05-14 17:17

【摘要】：目的:椎间盘退行性改变(intervertebral disc degeneration,IDD)的基本病理改变之一为组织内微血管生成,但尚无关于血管生成素(angiopoietin)在IDD中的相关研究。本实验拟探讨血管生成素1(angiopoietin-1,Ang-1)和血管生成素2(angiopoietin-2,Ang-2)在椎间盘髓核组织中的表达,并通过进一步的实验研究阐明它们在IDD中的作用及其机制。方法:采用免疫组化法检测椎间盘髓核组织中Ang-1和Ang-2的表达,并提取组织蛋白进行蛋白印迹实验,q RT-PCR检测基因m RNA水平,体外提取和培养原代髓核细胞,置于1.0Mpa静态压力下培养,采用黏附实验检测细胞黏附能力,MTT法测定细胞活力,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,并进一步构建鼠尾椎间盘Ang-2注射模型,进行MRI检测。最后通过Co-IP实验探究其中涉及的信号通路机制。结果:免疫组化结果显示,Ang-2在退变椎间盘髓核组织中表达较正常组织高,髓核组织中Ang-2/Ang-1比例随着患者退变等级增加而上升。在体外实验中,当给髓核细胞施加1Mpa大气压强时,细胞中Ang-2/Ang-1 m RNA和蛋白质水平增加,进一步功能研究发现,Ang-2能够使髓核细胞粘附能力和活力下降,促进髓核细胞凋亡。鼠尾椎间盘注射模型结果显示,Ang-2注射组较对照组椎间盘MRI信号变低,Ang-2显著促进了椎间盘退变等级的增加。Ang-1激活的Tie2受体和纤粘蛋白(fibronectin,FN)激活的整合素受体α5β1相互作用,募集下游局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)蛋白,共同作用激活了髓核细胞内PI3K/Akt信号通路,而Ang-2拮抗上述过程。结论:椎间盘退变过程中,Ang-2持续释放导致Ang-2/Ang-1比例增高,通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制了髓核细胞粘附能力和活力,加剧了细胞凋亡。本实验为椎间盘退变的病理机制研究提供了新思路。
【图文】：

处理压强为1.0 MPa 气压[22]。自制不锈钢密闭容器，自带气压计和温度计用以监测相应指标。细胞培养板放于容器中下部的托盘上，底部加入适量的双蒸水以保持湿润氛围（图1）。将压力锅放于 37℃培养箱中预热，将含压缩气体（CO2/空气比为5/95的混合气体）泵入自制密封容器内，充气速度保持持续渐进，直到压力值达到 1.0MPa [23]。图 1 自制压力培养容器外观图2.2.7 细胞免疫荧光染色细胞免疫荧光实验步骤：（1） 髓核细胞如上压力处理后进行爬片。在培养板中用 PBS 润洗细胞爬片，3 次，3min/次；

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文28图3 (A、B) 在压力处理0h、12h、24h、36h、48h后，WB检测髓核细胞中Ang-1和Ang-2蛋白水平并定量；(C) 在压力处理0h、12h、24h、36h、48h后，，WB检测髓核细胞中Ang-1和Ang-2 mRNA水平；(D) 在压力处理0h、12h、24h、36h、48h后，Elisa检测上清液中Ang-1和Ang-2 蛋白分泌水平；(E) 在压力处理0h、12h、24h、36h、48h
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5

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本文编号：2663685