载干细胞智能水凝胶的制备与骨修复性能研究

发布时间：2020-05-15 03:23

【摘要】：骨缺损是现今临床工作面临的重要问题。仅2011年,美国就有超过100万例外科手术涉及到骨缺损的修复。目前常用的自体骨移植和异体骨移植受限于来源有限,供体损伤,免疫排斥等问题。因此通过构建生物工程骨修复材料对骨缺损处进行修复成为了骨缺损修复的重要方向。水凝胶因其良好的生物相容性与安全性成为了生物工程的重要研究领域。智能水凝胶由于可以对外界产生响应性,根据温度,pH,压力等因素产生结构变化成为了微创修复骨缺损的理想材料。其可以通过注射方法到达骨缺损区域并且在调控下发生变化而完成对缺损区域的填充。人体有着相对稳定的pH环境与温度,因此具有pH敏感性与温度敏感性的水凝胶在人体内运用具有先天的优势。将种子细胞,诱导因子与智能可注射水凝胶复合有望构成理想的生物工程材料。本课题通过体内外实验检测了两种智能可注射凝胶作为载成骨分化干细胞骨修复材料的作用与效果。实验主要分为两部分:1.复合氧化石墨烯Graphene oxide与PPCN-g获得温度敏感性水凝胶GOP。首先通过流变学实验证GOP在保留温度响应性的同时获得了较高的弹性模量。荧光显微镜与扫描电镜证实细胞在GOP中粘附良好并在BMP9诱导下可在凝胶内产生丰富的胶原及矿化小节。Gluc检测证实相比与PPCN-g中,腺病毒感染的iMADs细胞可更稳定的长期存在于GOP并持续表达目标蛋白。碱性磷酸酶检测发现BMP9诱导组和对照组中GOP凝胶内iMADs碱性磷酸酶都高于PPCN-g组。qPCR检测发现在GOP参与下各阶段成骨因子表达明显增加,且GOP可以增强BMP9介导的成骨分化。裸鼠皮下异位成瘤模型证实GOP凝胶的运用可增强BMP9诱导下的iMADs细胞的体内成骨作用。同时免疫组化染色还提示成骨作用的增强除GO本身的成骨诱导能力外可能与其诱导的血管化相关。2.通过无定形磷酸钙与羧甲基壳聚糖有机复合形成CMC-ACP纳米微粒。CMC-ACP凝胶在具有良好的稳定性的同时具备pH响应性,可完成自组装。在人体pH范围内,CMC-ACP凝胶具有可注射性和3D打印可行性。将iMADs细胞载入CMC-ACP凝胶内培养后通过SEM与荧光显微镜观察我们发现iMADs细胞可以在凝胶内及凝胶表面粘附增殖并产生明显的矿化。Gluc检测提示细胞可以在凝胶内生存达15天并且持续表达目的蛋白。此外,CMC-ACP凝胶为细胞提供了成骨分化的有利环境:碱性磷酸酶染色与钙盐沉积染色均提示CMC-ACP凝胶可有效协同BMP9介导了间充质干细胞成骨分化。qPCR检测发现CMC-ACP诱导iMADs细胞成骨分化而抑制了成脂肪分化。这一结果同样在裸鼠皮下异位成骨的实验中得到了验证:虽然CMC-ACP不足以单独介导异位成骨的产生,但是可有效协同BMP9介导的异位成骨:MicroCT显示BMP9-CMC-ACP组骨块相比与BMP9-NA组具有高而均匀的骨质生成,同时CMC-ACP组具有良好的血管诱导能力。组织学检测发现CMC-ACP作为生物支架有效的提高了BMP9介导了成骨能力,在获得了更多而有序的骨小梁生成和更为丰富的血管长入,抑制了脂肪组织的生成。根据以上研究我们认为,pH与温度敏感性可注射凝胶复合BMP9介导的间充质干细胞成骨是构建具有生物活性的骨修复材料的有效方法。基于智能水凝胶的骨修复材料时为骨缺损的修复提供了一种可行的方向。
【图文】：

同配比（PPCN-g：GO）GOP 凝胶在温度变化过程中的粘弹性改The temperature evolution of GOP viscoelastic properties in differ(PPCN-g：GO)弹性检测测试了加入氧化石墨烯是否会影响 PPCN-g 粘弹性性能。按PPCN-g，置于冰上，检测不同配比情况下的流变学情况发改变了 PPCN-g 的粘弹性性能。我们发现单纯 PPCN-g 仅 GOP 混合(1:1 )表现出一种凝胶状结构,这提示 GO 的加入某种化学联接而起到了降低液相的作用，但是并没有改变P 仍然具有良好的可注射性。此外我们发现通过加入 GO弹性模量：在温度升高到 40 度的过程中，，PPCN-g 的存储模GO-P (1:1 PPCN-g：GO)的存储模量从 8 增加到 309 Pa(图

24图 2 GOP/PPCN-g 温度响应性与细胞装载能力 2 GOP/PPCN-g temperature response and cell loading capac
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68;R318.08

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本文编号：2664397