骨髓间充质干细胞通过旁分泌抗炎症蛋白TSG-6减轻椎间盘髓核细胞退变的机制研究

发布时间：2020-05-15 23:59

【摘要】：背景:下腰痛是临床最常见的症状之一,严重影响患者生活质量。椎间盘退变是导致下腰痛的主要原因,目前临床常用治疗手段疗效不佳,复发率较高。既往研究发现骨髓间充质干细胞(BMSCs)可修复退变椎间盘,但具体机制不清。最近研究证实BMSCs可通过旁分泌抗炎症蛋白肿瘤坏死因子-α诱导蛋白6(TSG-6)发挥器官保护作用。目前尚不清楚BMSCs对退变椎间盘的保护作用是否与其旁分泌的抗炎症蛋白TSG-6有关。因此本实验将利用针刺大鼠椎间盘退变模型、IL-1β诱导髓核细胞退变模型,深入研究BMSCs及其分泌的抗炎症蛋白TSG-6对退变椎间盘髓核细胞的保护作用及具体机制。方法:全骨髓贴壁法及贯序酶消化法分离培养大鼠BMSCs及椎间盘髓核细胞,并通过流式细胞术、免疫荧光技术等鉴定所培养细胞类型。本研究中我们构建了BMSCs与髓核细胞transwell共培养体系及针刺大鼠椎间盘退变模型,通过Real-time PCR、Western blot及免疫组化技术检测各组髓核细胞内TLR2/NF-κB信号通路关键分子、蛋白聚糖(aggrecan)、Ⅱ型胶原蛋白(collagen-Ⅱ)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)等的表达情况,运用免疫荧光技术观察髓核细胞内p65蛋白胞浆-胞核转位情况,使用ELISA试剂盒检测髓核细胞或髓核组织炎症因子含量,借助CCK-8法检测髓核细胞增殖情况,经MRI扫描观察各组大鼠椎间盘髓核组织含水量变化,使用HE染色及番红O-固绿染色观察各组大鼠椎间盘形态学改变。结果:全骨髓贴壁法分离的大鼠骨髓细胞呈长梭形,漩涡样生长,经流式细胞术检测及定向分化实验证实其为BMSCs。贯序酶消化法分离的髓核细胞呈多角形,免疫荧光染色证实其aggrecan及collagen-Ⅱ表达阳性。Real-time PCR及Western blot检测结果显示IL-1β可降低髓核细胞aggrecan、collagen-Ⅱ表达,同时提高MMP-3、MMP-13水平;BMSCs共培养及TSG-6重组蛋白处理均可提高退变髓核细胞内aggrecan、collagen-Ⅱ表达,同时抑制MMP-3、MMP-13表达,而BMSCs的这种保护作用可被TSG-6 siRNA减弱。进一步研究发现BMSCs及TSG-6可抑制退变髓核细胞内TLR2/NF-κB信号通路关键分子的表达,减少p65蛋白入核,降低细胞上清中炎症因子含量并促进髓核细胞增殖。HE染色、MRI扫描等证实针刺可引起大鼠椎间盘结构破坏及退变,而BMSCs移植及TSG-6注射均可修复退变的椎间盘、提高髓核组织含水量;此外,BMSCs移植及TSG-6注射可下调退变髓核组织内TLR2/NF-κB信号通路,降低髓核内炎症因子及细胞外基质降解酶含量。结论:BMSCs可通过旁分泌TSG-6下调退变髓核细胞TLR2/NF-κB信号通路,抑制其下游炎症因子及基质金属蛋白酶等的合成,从而改善退变髓核组织炎症微环境、促进髓核细胞增殖并修复退变椎间盘。
【图文】：

间充质干细胞,相差显微镜,生长情况,形态

14图 1 倒置相差显微镜观察大鼠骨髓间充质干细胞形态及生长情况(100×)Figure 1 Morphological observation of BMSCs used in this study (100×)大鼠 BMSCs 原代培养 48h 后，部分细胞呈贴壁生长，此时有大量悬浮的其他混杂细胞(A);大鼠BMSCs 原代培养 5 天后，可见数个细胞克隆形成，细胞呈纺锤样、长梭形(B)；第 3 代大鼠 BMSCs传代后 24h, 细胞细胞呈纺锤样、长梭形，细胞形态单一，呈漩涡样、聚集性生长(C)；第 3 代大鼠 BMSCs 传代后 72h, 细胞已长满培养皿皿底，呈漩涡样、聚集性生长(D)。Morphological observation of rat BMSCs. After primary culture for 48h, some cells adhered to the cellculture dish, meanwhile, there are a large number of other mixed cells were suspended in the cell culturemedium (A);After primary culture for 5 days, several BMSCs colonies were observed，BMSCs showedfusiform or long spindle shapes (B); The passage 3 BMSCs cultured for 24h，BMSCs showed spindleshapes and the presence of vortex-like growth (C)；The passage 3 BMSCs cultured for 72h, BMSCs

间充质干细胞,表面标志,鉴定结果,阳性率

上海交通大学博士学位论文were long spindle in shape and were arranged in an organized fashion(D).1.3.2 大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定将长至 80-90%融合的第 3 代 BMSCs 收集后，经抗大鼠 CD29-PE、CD45-FITC、CD90-PE、CD34-FITC 单克隆抗体及相应同型阴性对照抗体处理后，流式细胞仪检测表面抗原，结果显示：CD29 阳性率为 99.81%，CD90 阳性率为 99.55%，，CD45 阳性率为0.01%，CD34阳性率小于0.01%。说明本实验中我们分离及体外培养的BMSCs纯度较高(图 2)。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5

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