七氟烷后处理基于TLR4-NF-κB通路对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

发布时间：2020-05-15 19:05

【摘要】：研究背景缺血再灌注损伤是长期、严重脑损伤的主要原因之一。缺血再灌注损害神经元功能并导致细胞死亡,尤其对海马锥体神经元。缺血性脑卒中往往发生在大脑主要动脉阻塞时,大脑中动脉闭塞(MCAO)正是一种广泛接受的用于研究缺血机制的动物模型。尽管缺血再灌注卒中在临床上有很高的发生率和病死率,但目前仍然缺乏有效的治疗方法来减轻由此引起的神经损伤。Toll样受体-4(TLR4)是大脑中的第一道防线,主要位于神经胶质细胞上,包括小胶质细胞,星形胶质细胞和橄榄核细胞。Toll样受体(TLR)属于主要的非抗原特异性先天免疫机制。它们包括了一系列受体,这些受体在其配体结合后可用于识别与病原体相关的分子模式。它们还诱导几种激酶和核因子-κB(NF-κ B)的激活。NF-κ B作为炎症反应的中枢调节因子,也影响信号通路TLR4并诱导许多参与先天免疫的促炎介质。研究表明,TLR4/NF-KB通路与炎性细胞因子的释放密切相关,与心肌缺血再灌注损伤密切相关。近年来,七氟醚在缺血再灌注损伤中的作用越来越引起人们的关注。研究表明,七氟醚后处理可通过降低血清肿瘤坏死因子-a(TNF-a),白细胞介素-1β(IL-1β),一氧化氮(NO),一氧化氮合酶(NOS)来增强免疫力并且还降低了人内皮细胞中TLR2和TLR4的表达以及炎症标志物。研究表明,自噬和细胞凋亡参与了不同类型的脑损伤。自噬是一种自我降解的过程,与许多神经退行性疾病的病理过程有关。越来越多的证据支持自噬通过降解细胞自身内蛋白质和细胞器,激活细胞凋亡以促进细胞死亡。Caspase-3和B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)是重要的凋亡调节因子,可以决定细胞的命运。此外,1轻链3(LC3)和Beclin-1参与神经元自噬的调节。在许多严重的人类疾病中观察到炎症或自噬途径或两者的紊乱,所以关于这些途径之间的相互作用的信息不仅对于阐明人类病症的分子基础至关重要,对于阐明一般细胞信号传导途径可能也是相当重要的。众多的研究表明,通过抑制TLR4/NF-kB信号通路可以改善脑细胞的凋亡。然而,尚不清楚TLR4/NF-κB信号通路是否参与MCAO诱导的I/R脑损伤。七氟醚是一种常用的挥发性麻醉剂,最近,许多研究表明,七氟醚后处理具有神经保护作用。然而,七氟醚保护作用的潜在机制尚不完全清楚。因此,在本研究中,我们假设七氟醚通过抑制脑缺血期间的炎症反应、自噬和细胞凋亡而发挥神经保护作用,试图通过TLR4-NF-κ B途径验证七氟醚是否能改善MCAO大鼠的脑损伤。研究目的:1.建立大鼠脑缺血再灌注模型,对每组大鼠进行不同处理,探讨基于TLR4-NF-κ B通路,七氟烷后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤抗炎作用研究。2.探讨七氟醚后处理对脑缺血再灌注损伤后自噬水平的影响。研究方法:第一部分:将30只健康成年大鼠,随机分为3组,每组10只。分为假手术组(Sham)、缺血再灌注损伤组(I/R)、七氟烷后处理组(Se)。建立大鼠MCAO模型,给予各组大鼠不同的七氟烷处理。然后采用H-E染色法观察各组大鼠大脑梗死区域炎症反应水平,采用ELISA法检测血清中促炎细胞因子INF-a、IL-1、IL-6的浓度,采用CRT及Western Blot检测各组大鼠脑组织中TLR4、NF-κ B p65的mRNA及蛋白表达水平。第二部分:将40只健康成年大鼠(雄性),随机分为4组,每组10只。分为假手术组(Sham)、缺血再灌注损伤组(I/R)、七氟烷后处理组(Se)、QNZ(EVP4593)(抑制剂)组。建立大鼠MCAO模型,给予各组大鼠不同的处理。采用Morris水迷宫实验评价大鼠空间学习记忆能力;TTC染色观察脑组织梗死面积;TUNEL检测神经细胞凋亡;免疫组化检测脑组织中TLR4和NF-KB蛋白表达;透射电镜观察自噬小体;Western blot检测自噬相关蛋白及细胞凋亡相关蛋白的表达。研究结果:第一部分:(1)七氟烷后处理可降低缺血再灌注大鼠脑梗死区域炎症反应水平。(2)七氟烷后处理可降低缺血再灌注大鼠血清中促炎细胞因子INF-a、IL-1、IL-6的浓度。(3)七氟烷后处理可抑制TLR4-NF-κ B通路上关键基因TLR4、NF-kBp65的mRNA表达。(4)七氟烷后处理可抑制TLR4-NF-κ B通路上关键蛋白TLR4、NF-kBp65的表达。第二部分:(1)七氟烷后处理可改善由于脑缺血再灌注损伤而带来的学习、记忆功能障碍。(2)七氟烷后处理可减小脑组织梗死面积。(3)七氟烷后处理可降低神经细胞凋亡指数,减少神经细胞凋亡。(4)七氟烷后处理可抑制脑组织中蛋白TLR4和NF-kB的表达。(5)七氟烷后处理可减少自噬小体空泡的形成。(6)七氟烷后处理可抑制自噬相关蛋白LC3I、LC3II和Beclin-1以及凋亡标记蛋白Bad和Caspase-3的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。研究结论1.七氟烷后处理能降低脑缺血再灌注损伤引起的大鼠脑梗死区域的炎症反应,降低血清中促炎细胞因子浓度,而起到神经保护作用,该保护作用机制可能与TLR4-NF-κ B信号通路有关。2.七氟烷后处理可改善由于脑缺血再灌注损伤而带来的学习、记忆功能障碍,减小脑组织梗死面积和神经细胞凋亡,下调脑组织中TLR4和NF-κ B蛋白表达,减少自噬小体空泡的形成,抑制自噬相关蛋白以及细胞凋亡蛋白表达。因此,七氟烷后处理可通过抑制自噬和细胞凋亡来发挥神经保护作用,其对脑缺血再灌注损伤后自噬水平的影响机制与TLR4-NF-κB信号通路具有相关性。
【图文】：

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注：与假手术组相比，＾＜０．０５；与缺血再灌注损伤组相比，逡逑５．３七氟烷后处理对ＴＬＲ４－ＮＦ－ＫＢ通路上关键基因表达的影响逡逑如图３所示，与假手术组比较，缺血再灌注损伤组的ＴＬＲ４ｍＲＮＡ、ＮＦ－ｋＢ逡逑ｐ６５ｍＲＮＡ表达升高至３．０８ｅｑ和２．邋ｌｌｅｑ，，七氟烷后处理组升为１．７９ｅｑ．、１．３９ｅｑ，逡逑差异均具有统计学意义（／Ｙｆｔ邋０５）；与缺血再灌注损伤组相比，七氟烷后处理组逡逑ＴＬＲ４邋ｍＲＮＡ和ＮＦ－ｋＢ邋ｐ６５ｍＲＮＡ的表达明显降低（代历）。以上结果证明，七逡逑氟烷后处理可显著抑制ＴＬＲ４－ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ通路上关键基因的表达。逡逑４．０邋ｒ逡逑？逦Ｉ邋ｉ邋Ｓｈａｍ逡逑３．５邋－逦Ｉ邋Ｒ逡逑Ｚ逦逦Ｓｅ逡逑＾邋３．０邋－逦ｗｍｍｍｍ逡逑－Ｂ邋＿Ｌ逡逑－

七氟烷,缺血再灌注损伤,上关,后处理

注：与假手术组相比，＾＜０．０５；与缺血再灌注损伤组相比，逡逑５．３七氟烷后处理对ＴＬＲ４－ＮＦ－ＫＢ通路上关键基因表达的影响逡逑如图３所示，与假手术组比较，缺血再灌注损伤组的ＴＬＲ４ｍＲＮＡ、ＮＦ－ｋＢ逡逑ｐ６５ｍＲＮＡ表达升高至３．０８ｅｑ和２．邋ｌｌｅｑ，七氟烷后处理组升为１．７９ｅｑ．、１．３９ｅｑ，逡逑差异均具有统计学意义（／Ｙｆｔ邋０５）；与缺血再灌注损伤组相比，七氟烷后处理组逡逑ＴＬＲ４邋ｍＲＮＡ和ＮＦ－ｋＢ邋ｐ６５ｍＲＮＡ的表达明显降低（代历）。以上结果证明，七逡逑氟烷后处理可显著抑制ＴＬＲ４－ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ通路上关键基因的表达。逡逑４．０邋ｒ逡逑？逦Ｉ邋ｉ邋Ｓｈａｍ逡逑３．５邋－逦Ｉ邋Ｒ逡逑Ｚ逦逦Ｓｅ逡逑＾邋３．０邋－逦ｗｍｍｍｍ逡逑－Ｂ邋＿Ｌ逡逑－邋■■逡逑１0０＿逡逑％：ＩＩ逦■逦Ｉ邋Ｉ邋■逡逑ＴＬＲ４邋ｍＲＮＴＡ逦ＭＦ－ｋ：邋Ｂ邋ｐ６５ｍＲｌＳＩＡ逡逑图３七氟烷后处理对ＴＬＲ４－ＮＦ－ＫＢ通路上关键基因表达的影响逡逑注：与假手术组相比，Ｔ＜０．0５；与缺血再灌注损伤组相比，炉＜０．０５。逡逑第２１页共１１２页逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614

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