脉冲磁场增强SPIO标记的BMSCs成软骨分化的研究

发布时间：2020-05-15 18:29

【摘要】：目的:探究脉冲磁场增强SPIO(superparamgnetic iron oxide,超顺磁氧化铁)标记的骨髓间充质干细胞增殖和诱导成软骨细胞分化的能力以及对体内软骨组织缺损的修复治疗。方法:SPIO合成与表征:将1 mmol三乙酰丙酮铁,2.5 mmol 1,2-十六烷二醇,1 mmol油酸和3 mmol油胺加入到10毫升苄醚中,磁力搅拌,将所得混合物加热至200℃达15分钟,再加热至300℃,回流1小时,所获得的SPIO沉淀用低分子量两亲性烷基化PEI2000进一步修饰,透射电镜(TEM)观察所合成SPIO颗粒,并通过动态光散射粒径仪(DLS)来测SPIO的粒径大小。脉冲磁场增强体外SPIO标记的骨髓间充质干细胞增殖和成软骨细胞分化的能力以及TGF-β/SMAD信号通路的探究:提取3-7天SD大鼠的骨髓间充质干细胞在体外培养传代至第三代,MTT检测在不同浓度SPIO对骨髓间充质干细胞毒性的影响。通过普鲁士蓝染色,观察不同浓度SPIO标记的骨髓间充质干细胞阳性细胞数。实验分组为:对照组,SPIO组,PMF组,PMF-SPIO组。MTT筛选出脉冲磁场下最佳的时长。Annexin V~+/PI~-来验证不同条件下各个组别对骨髓间充质干细胞的凋亡影响。MTT验证在不同天数1、2、3、4、5天脉冲磁场对骨髓间充质干细胞增殖的影响。骨髓间充质干细胞诱导分组,不加TGF-β~—组(B组,BP组,BS组,BSP组)和加TGF-β~+组(BT组,BTP组,BTS组,BTSP组)。骨髓间充质干细胞培养7天,14天和21天,进行GAG/DNA的检测,成软骨分化的特殊标志基因Acan、Col2a1和Sox9表达检测。各个实验组中通过免疫蛋白印记(WB)验证脉冲磁场刺激的条件下骨髓间充质干细胞分化为成软骨细胞的过程中TGF-β/SMAD信号通路相关蛋白表达的影响,检测其有关蛋白的表达变化水平,从而验证脉冲磁场在细胞水平的影响。脉冲磁场来刺激SPIO标记的骨髓间充质干细胞对体内软骨缺损再生的验证:MRI来检测SPIO标记的骨髓间充质干细胞的T_2信号值,以及植入SPIO标记的骨髓间充质干细胞关节腔内的T_2信号值。构建关节软骨缺损模型,将不同组别(B组、BP组、BS组、BSP组)的骨髓间充质干细胞注射到关节腔内对缺损部位进行修复。在第八周后取材,并对关节进行大体评分观察其修复情况,固定后组织切片,进行HE染色,番红固绿染色以及免疫组化染色,来观察不同组之间的修复效果。结果:制备出,在形态上是粒径大小均一的SPIO纳米颗粒。MTT验证在SPIO浓度为10μg/mL,20μg/mL,30μg/mL和40μg/mL的条件下相比于对照组,对细胞活性没有影响。普鲁士蓝染色验证了随着SPIO浓度的增加,细胞基质中蓝色铁颗粒显著的增多。在脉冲磁场的条件下筛选出其最佳的作用时长为30min。流式结果显示了SPIO和脉冲磁场对骨髓间充质干细胞没有凋亡的影响。此外还验证了在脉冲磁场刺激的条件下SPIO标记的骨髓间充质干细胞增殖率显著的上升。在脉冲磁场的条件下SPIO标的骨髓间充质干细胞GAG的分泌以及相关软骨特殊基因Acan、Col2a1和Sox9的表达水平都显著升高。在蛋白水平,验证了脉冲磁场的条件下能够增强SPIO标记骨髓间充质干细胞在分化过程中的TGF-β/SMAD信号通路。体内实验通过取组织观察,以及相关的组织学染色,验证了脉冲磁场的条件下能够增强SPIO标记骨髓间充质干细胞对软骨缺损部位的修复。结论:在本研究中,脉冲磁场代表了一种非侵入性方法来增强骨髓间充质干细胞的增殖以及软骨特异性基因表达,通过暴露于脉冲磁场SPIO标记的骨髓间充质干细胞改善其向软骨形成分化能力,提供连续和稳定的刺激,克服了先前使用生长因子在体内的应障碍。并为软骨再生的提供有效线索。我们的研究结果显示代表一种可以实现的基于细胞对受损软骨组织治疗策略。
【图文】：

SPIO的TEM结果图

图 1.2 SPIO 纳米颗粒的 DLS 图Figure 1.2 The DLS specture of SPIO铁纳米颗粒已成为最常用的磁性纳米颗粒，在生物医学应用[24]。因为他们的低成本，低毒性，，具有独特的超方面，制备具有所需性能和高潜力应用型的氧化铁纳重要的[25]。当氧化铁纳米颗粒被设计用于生物医学应米颗粒的尺寸大小和流体力学[26]。适当的流体动力学和于控制血管中的纳米颗粒浓度分布，改善了循环系统中透性和易清除性。例如，研究报道表明，小的纳米颗粒
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68

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本文编号：2665460