PIP调控LEA29Y转基因猪的繁育及表征

发布时间：2020-05-16 13:05

【摘要】：胰岛移植可治疗糖尿病、维持患者血糖平衡,但受供体器官短缺及术后免疫排斥的制约,无法充分展开。研究表明胰岛移植术后排斥反应主要以T细胞介导的细胞排斥为主以及猪是胰岛移植供体的理想备选。LEA29Y是一种人工合成的新型免疫抑剂,可阻断CD28和B7.1/CD80或B7.2/CD86之间的共刺激信号,防止T细胞的活化,LEA29Y转基因猪可抑制异种胰岛移植面临的T细胞介导的免疫排斥。然而,广泛性表达LEA29Y会导致转基因猪免疫力低下、不易存活。实现转基因猪胰岛特异性表达LEA29Y可以避免这些问题。因此制备PIP(猪胰岛素启动子)调控的转基因猪并筛选培育出遗传及表达稳定的健康胰岛特异性表达LEA29Y转基因种群,对进一步研究LEA29Y在哺乳动物体内的机制以及为胰岛移植提供充足可靠地供体是有意义的。课题组已于2014年成功获得PIP(猪胰岛素启动子)调控的转基因原代猪,现今已繁育至F2代。本论文以现有的胰岛特异性表达LEA29Y猪种群为研究对象,应用PCR、RT-PCR、Western印迹、免疫组化、免疫荧光等分子手段对在LEA29Y基因水平的鉴定、目的蛋白的表达模式等方面做了初步探究,同时对种群内LEA29Y遗传及表达的稳定性进行了分析;通过血常规检查、石蜡切片及HE染色等方式对胰岛特异性表达LEA29Y转基因猪的健康水平进行了评估。结果显示:1.本课题组制备的3头LEA29Y转基因原代猪,DNA水平检测均为LEA29Y阳性。抽检原代猪81,发现在转录水平及蛋白水平均可以实现胰腺特异表达LEA29Y。2.通过自然配种的方式可实现胰腺特异表达LEA29Y猪种群的扩繁。原代猪81基因组内同时整合完整及不完整的的LEA29Y载体片段,并可将不完整载体片段单独遗传给部分后代,不完整载体片段不表达LEA29Y但不会对完整LEA29Y序列的表达造成影响,单独遗传不完整片段的个体可通过检测LEA29Y序列完整性来排除。除此之外81及其与野生型猪的遗传了完整目的载体的后代可以实现胰岛特异性表达LEA29Y,继代遗传稳定,可为异种胰岛移植提供充足的供体。其余2头原代猪发现存在非特异表达LEA29Y的情况,其后代可能会有益于其它器官的移植。3.胰岛特异性表达LEA29Y对转基因猪的血液生理指标和胸腺、淋巴结等免疫器官的繁育无明显影响,转基因猪健康水平良好,有利于为异种胰岛移植提供可靠地供体。总之,本研究通过对本课题组制备的胰岛特异性表达LEA29Y转基因猪的鉴定、繁育、筛选及进行健康水平评估,成功获得了继代遗传稳定、健康的胰岛特异性表达LEA29Y猪种群,可为胰岛移植提供充足、可靠地供体。
【图文】：

核苷酸序列,引物设计,位置,引物

图 1 鉴定引物设计位置Figure.1 The location of primers on the plasmid表 1 本研究使用的 PCR 引物信息Table1 Information of PCR primers used in the study引物名称核苷酸序列（5’-3’）扩增序列大小（Kbp）退火温度（℃）引物用途PIP-F/R F:ACACCCTCTCATAGAGGCCC0.52 64 PCR 检测启动子区；RT-PCR 检测DNA 污染R:GGGCCTCGAGGTCATTAGAGLEA-F1/R1 F:ATGGCTTGCCTTGGATTTC1.2 62 PCR 检测完整目的基因，RT-PCR 检测 LEA29Y 是否转录。R:TCATTTACCCGGAGACAGGL-F/R F:GGAGCCCAAATCTTCTGACAA0.544 58 灵敏度较高，扩增 LEA29Y 后半部分R:GGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGAPDH-F/R F:CGTGCCGCCTGGAGAAA0.179k 58 RT-PCR 时检测 cDNA 完整性。

转基因猪,PCR鉴定

结果转基因猪（编号 77、81、83）和 1 头野生型猪耳样，，提取用 L-F/R 引物检测目的基因 LEA29Y；GAPDH-F/R 引NA 提取质量，凝胶电泳（图 2）显示：4 头猪均可以检可；除对野生型猪外，3 头原代转基因猪可扩出目的大小一致，为阳性个体。液漂洗三次，每次 5min；于 5% 脱脂奶粉稀释的一抗溶液（1 TBST 缓冲液洗脱三次，每次 5 min；加入 TBST 稀释的二抗孵育 1 h；TBST 缓冲液漂洗三次，每次 5 min。化物显色液 2ml 孵于膜上，Tanon 5200 全自动化学发光仪显影
【学位授予单位】：山西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R657.5

【参考文献】