肥大细胞在STZ诱导的小鼠糖尿病心肌病中的作用机制研究

发布时间：2020-05-17 06:40

【摘要】：目的:探讨肥大细胞(mast cells,MCs)在链腺佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的小鼠糖尿病心肌病中的作用及其机制。方法:1.体内实验:在C57BL/6野生型(wide type,WT)小鼠及肥大细胞缺陷型小鼠(KitW-sh/W-sh)的基础上,建立由STZ诱导的小鼠糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)模型;同时,自 C57BL/6 野生型小鼠、白介素 6(interleukin 6,IL-6)基因敲除小鼠(IL-6-/-小鼠)及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)基因敲除小鼠(TNF-α-/-小鼠)中分离培养骨髓来源的肥大细胞(bone marrow-derived mast cells,BMMCs),回输至 Kitw-sh/w-sh 糖尿病心肌病小鼠中,以达到肥大细胞重建的目的。实验动物共分为7组,包括(1)C57BL/6野生型小鼠(WT);(2)糖尿病心肌病小鼠(WT + STZ);(3)肥大细胞缺陷型小鼠(Kitw-sh/W-sh);(4)伴有肥大细胞缺失的糖尿病心肌病小鼠(Kitw-sh/w-sh+STZ);(5)伴有肥大细胞缺失的糖尿病心肌病小鼠给予回输C57BL/6野生型小鼠的肥大细胞(Kitw-sh/w-sh +STZ + WT-BMMCs);(6)伴有肥大细胞缺失的糖尿病心肌病小鼠给予回输IL-6-/-小鼠的肥大细胞(KitW-sh/w-sh+STZ + IL-6-/--BMMCs);(7)伴有肥大细胞缺失的糖尿病心肌病小鼠给予回输TNF-α-/-小鼠的肥大细胞(Kitw-sh/W-sh + STZ +TNF-α-/--BMMCs)。STZ注射后监测血糖并在4周后,进行下列检测:(1)超声检测各组小鼠心室重构程度及心脏收缩功能,包括舒张期心室间隔厚度(interventricular septum,diastole,IVS;d),舒张期左心室内直径(left ventricular internal diameter,diastole,LVID;d),以及舒张期左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall,diastole,LVPW;d)和缩短分数(fractional shortening,FS%)四项指标;(2)测量各组小鼠心脏质量,利用心脏质量指数(Heart weight index,HWI)反映心脏肥大程度;(3)通过甲苯胺蓝染色检测存在于各组小鼠心脏组织中的肥大细胞;(4)苦味酸-天狼星红(Picric sirius red)染色后,通过偏振光显微镜观察小鼠心脏组织中Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)和Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ)的表达情况,以反映心脏纤维化程度;(5)RT-PCR检测各组小鼠心脏组织中TNF-α与IL-6的表达情况;(6)RT-PCR检测各组小鼠心脏组织中细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)及赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase)的表达情况;(7)TUNEL染色观察各组小鼠心脏组织中的细胞凋亡情况。2.体外实验:在分离培养C57BL/6野生型小鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞后,利用来源于WT-BMMCs,IL-6-/--BMMCs及TNF-α-/--BMMCs的裂解液处理以上两种细胞,进行下列检测:(1)Western blot检测心肌成纤维细胞中 smad 2,p-smad 2,smad 3,p-smad 3,α-SMA,collagen Ⅰ和collagen Ⅲ等心肌纤维化相关指标的变化;(2)通过对心肌细胞形态学的观察与计算,得出裂解液处理后心肌细胞死亡的比率,同时通过Western blot进一步检测Bax,Bcl-2及Cleaved caspase 3等凋亡相关指标在心肌细胞中的变化。结果:1.体内实验证实:(1)在STZ诱导的糖尿病小鼠造模成功后,各组小鼠血糖均明显升高,体重明显减低仅出现在WT + STZ组小鼠及回输WT-BMMCs的Kitw-sh/W-sh+STZ组小鼠;(2)经甲苯胺蓝染色后发现,与WT组相比,WT + STZ小鼠心脏组织中的肥大细胞数量明显增加,提示糖尿病小鼠心脏组织中有肥大细胞浸润;(3)肥大细胞缺失可降低糖尿病心肌病小鼠HWI,改善室间隔与左心室后壁的增厚,减小左心室内直径,提高心脏收缩功能,但这一保护效应在回输WT-BMMCs的Kitw-sh/w-sh+STZ组小鼠中被削弱;(4)此外,通过苦味酸-天狼星红染色发现肥大细胞缺失可抑制糖尿病心肌病小鼠的心肌纤维化,而且RT-PCR结果提示肥大细胞可刺激细胞间黏附分子1及赖氨酰氧化酶的表达增加,且这一途径主要与其分泌的TNF-α有关;(5)TUNEL染色证实肥大细胞缺失可减少心肌细胞凋亡。2.体外实验进一步验证肥大细胞对心肌纤维化与心肌细胞凋亡的影响:(1)通过利用来源于WT-BMMCs、TNF-α-/--BMMCs、IL-6-/--BMMCs三种细胞的裂解液处理心肌成纤维细胞,进一步证实了肥大细胞可通过激活p-smad2/p-smad 3途径促进心肌成纤维细胞合成Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原;(2)同时,体外实验也证实了肥大细胞促进了心肌细胞的凋亡,且这一途径主要与其分泌的IL-6促进Bax及Cleaved caspase 3等凋亡相关蛋白的表达增多有关。结论:1.肥大细胞参与了糖尿病心肌病的形成,在肥大细胞缺失的情况下可减轻心室重构,改善心脏功能。2.肥大细胞缺失后使心肌纤维化减少,心肌细胞凋亡受到抑制,从而实现改善糖尿病心肌病的效应,而在这一过程中,肥大细胞分泌的IL-6与TNF-α起到了重要作用。3.本实验通过利用多种基因缺陷动物模型,得到较为可靠的结果,反映了肥大细胞在糖尿病心肌病中的作用途径,使我们对肥大细胞与糖尿病心肌病的关系有了新的认识,也为未来临床应用免疫相关手段(如肥大细胞稳定剂)治疗糖尿病心肌病提供了重要的基础理论依据。
【图文】：

和试验目的分为如下３组：术后即刻的生物力学组３头，术后１２周的生物力学组３逡逑头，术后１２周的Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ扫描和病理组织切片组３头。逡逑实验猪均为单笼圈养，活动面积约１．５平方米（图１－１），手术前不予限制活动，逡逑给予标准饮食，颗粒饲料喂养。所有实验猪的圈养和手术均严格遵守解放军总医院逡逑实验动物伦理委员会关于保护实验动物的各种规章制度，且本课题组所有成员承诺逡逑在任何时候均不会发生任何违反上述规章制度的行为。逡逑ｆｍｍ逡逑■Ｈ逡逑图１－１．实验猪予以单笼饲养，活动面积约１．５平方米。逡逑实验猪于术前一周左右采购入实验动物中心大动物实验室圈养，一般术前饲养逡逑一周左右适应周围环境，观察实验猪在大动物实验室圈养过程中无异常反应，饮食、逡逑１１逡逑

和试验目的分为如下３组：术后即刻的生物力学组３头，术后１２周的生物力学组３逡逑头，术后１２周的Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ扫描和病理组织切片组３头。逡逑实验猪均为单笼圈养，活动面积约１．５平方米（图１－１），手术前不予限制活动，逡逑给予标准饮食，颗粒饲料喂养。所有实验猪的圈养和手术均严格遵守解放军总医院逡逑实验动物伦理委员会关于保护实验动物的各种规章制度，且本课题组所有成员承诺逡逑在任何时候均不会发生任何违反上述规章制度的行为。逡逑ｆｍｍ逡逑■Ｈ逡逑图１－１．实验猪予以单笼饲养，活动面积约１．５平方米。逡逑实验猪于术前一周左右采购入实验动物中心大动物实验室圈养，，一般术前饲养逡逑一周左右适应周围环境，观察实验猪在大动物实验室圈养过程中无异常反应，饮食、逡逑１１逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R542.2

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本文编号：2668102