创伤性脑损伤miRNA和蛋白分子标志物筛选及调控研究

发布时间：2020-05-20 08:39

【摘要】：背景:创伤性脑损伤是神经外科最常见的疾病,是主要的致死及致残因素之一,但是目前临床上尚没有公认的诊断TBI的分子标志物,特别是轻度TBI因无明显影像学改变,无明显神经系统定位体征,一直是临床及法医学鉴定的难点。有研究发现TBI可引起脑组织基因和蛋白质表达谱的变化,检测体液中基因和蛋白质的表达变化发现其中部分与脑组织的损伤程度和临床预后密切相关,因而这些损伤前后表达变化差异显著的基因和蛋白质成为TBI潜在的生物标志物。miRNA是一类高度保守的单链RNA,血液中90%的miRNA以核酸-蛋白复合物形式存在,具有高度稳定性和抗降解能力,且不随个体差异、温度、pH值、时间和酶的存在与否而变化,这些特点使体液miRNA可能成为理想的疾病标记物。蛋白质作为生命活动的执行者和体现者,随生命活动的进程表现出紧密而协调的变化,在TBI生物标志物的寻找过程中,也有不少研究者将目标聚焦于蛋白质。虽然已有不少候选生物标志物被提出,但由于重现性差,仅有少部分对具有影像学改变的中、重度TBI的诊断和预后判断具有参考意义,至今尚未用于临床诊断,而用于轻度TBI诊断的生物标志物迄今未见报道,同时上述候选生物标志物表达变化与TBI损伤机制及临床预后的关系远未阐明。本课题组前期应用2DE-MALDI-TOF/MS _3研究了大鼠轻度脑损伤后脑组织及血清蛋白质表达,确认了15个损伤前后表达差异的蛋白;应用生物信息学和网络扰动等实验方法,初步证实脑损伤相关基因水平和蛋白表达水平变化不一致很可能是通过miRNA抑制了基因的转录。目的:1.应用miRNA基因芯片和iTRAQ定量蛋白组学技术筛选TBI患者血浆中的生物标志物,并进行验证及评价,以期寻找TBI临床诊断客观指标;2.应用生物信息学技术分析参与TBI后病理进程的生物过程及信号通路,为阐明其发病机理、寻找其治疗靶点提供理论基础。方法:1.样本收集:按照标准收集轻度、中度、重度TBI患者以及健康对照人员血浆各30例;2.miRNA芯片:选取每组5例样本应用miRNA芯片进行检测,分析数据,比较不同损伤程度TBI患者血浆样本差异miRNA表达谱,应用生物信息学技术对差异miRNA的靶基因进行富集分析,筛选潜在的诊断分子标志物,然后应用RT-qPCR对这些miRNAs进行扩大样本验证,ROC曲线分析各miRNA诊断TBI的特异性和灵敏度;3.iTRAQ定量蛋白组学分析:将血浆样本酶解后应用iTRAQ试剂进行标记,经分离后行质谱检测,然后对所得数据进行信息学分析,比较各组差异蛋白表达,并应用生物信息学技术对差异蛋白进行富集分析,应用ELISA对选取的差异蛋白及其上下游关键蛋白进行验证,ROC曲线分析各蛋白诊断TBI的特异性和灵敏度。结果:1.受试者临床特征:共有90名符合条件的TBI患者及30名健康志愿者纳入研究。轻、中、重度TBI组及对照组各5例样本进行miRNA芯片和iTRAQ检测,轻_4、中、重度TBI组患者从受伤至采血时间分别为7.54±2.81h,6.08±0.79 h,6.16±1.19 h,各组间无统计学差异。轻、中、重度TBI组及对照组各25例进行后续验证实验,轻、中、重度TBI组患者从受伤至采血时间分别为7.22±1.75 h,7.16±1.57 h,6.53±1.56 h,各组间无统计学差异。2.miRNA芯片结果及验证:(1)与对照组相比,轻、中、重度TBI组患者血浆分别有65,33和16个miRNAs表达上调,29,27和6个miRNAs表达下调。其中三组损伤组都有显著改变的有13个miRNAs(其中7个上调,6个下调)。(2)miRNA靶基因GO富集分析结果显示,轻度及中度TBI患者组出现10个共同的生物过程,而只有血管加压素对全身动脉血压的调节这一生物过程在轻、中、重度TBI组均出现。这些结果证明轻度及中度TBI可能具有相近的病理进程。(3)Pathway富集分析结果显示,几条重要的通路均参与轻、中、重度TBI的损伤进程,包括:p53信号通路、mTOR信号通路、TGF-beta信号通路、泡囊运输中的诱捕相互作用、烟酸和烟酰胺代谢、神经营养蛋白信号通路。此外,两种神经生物学通路:泛酸盐和CoA生物合成,长时程抑制则只出现在轻度TBI组的前15个通路中。(4)我们选择芯片结果中与正常组血浆相比各损伤组患者血浆中均表达上调的miRNAs(miR-6867-5p,miR-3665,miR-328-5p,miR-762,miR-3195,miR-4669and miR-2861)进行qRT-PCR验证。qRT-PCR验证结果与芯片结果一致:与对照组相比,轻、中、重度TBI组患者血浆中7种miRNAs均显著增高,重度TBI组中miR-3195,miR-328-5p表达水平比轻、中度TBI组显著增高,重、中度TBI组中m_5iR-6867-5p表达水平比轻度TBI组显著增高。(5)采用ROC曲线方法来计算ROC曲线下的面积,以评估这七个miRNAs诊断TBI的准确性。各miRNA的AUC值分别为:miR-6867-5p(0.854,P0.001),miR-3665(0.877,P0.001),miR-328-5p(0.888,P0.001),miR-762(0.916,P0.001),miR-3195(0.899,P0.001),miR-4669(0.907,P0.001),and miR-2861(0.913,P0.001)。所有miRNAs都显示出良好的诊断准确性。(6)ROC分析这些miRNAs是否可以用于诊断轻度TBI(mTBI)。AUC值如下:miR-6867-5p(0.765,P0.001),miR-3665(0.916,P0.001),miR-328-5p(0.855,P0.001),miR-762(0.921,P0.001),miR-3195(0.859,P0.001),miR-4669(0.894,P0.001),and miR-2861(0.898,P0.001),所有这些miRNAs在鉴别轻度TBI患者时都具有一定的诊断准确率,其中miRNA-3665和miR-762在诊断轻度TBI患者时具有较好的诊断准确率。3.iTRAQ结果及验证:(1)iTRAQ定量实验共鉴定到5035条肽段和1109个蛋白。与健康对照组相比,轻度、中度和重度TBI组表达上调的蛋白数分别为90、92和103,表达下调的蛋白数分别为42、58和58。(2)差异蛋白的GO富集分析结果显示,TBI损伤后差异蛋白更多与急性期反应,急性炎症反应,损伤反应,应激反应,血小板活化,损伤修复,凝血等生物进程相关。其中轻度TBI和中度TBI组富集结果更加接近,而重度TBI的生物进程中脂质代谢相关的生物进程如甘油三酯分解代谢过程的调控,脂质分解过程的调节,甘油三酯代谢过程的调控,甘油三酯代谢过程的正向调节,排名相对比较靠前。(3)pathway富集分析结果显示,三组_6 TBI均涉及到的信号通路有Hippo信号转导途径,补体与凝血级联反应和沙门氏菌感染。(4)ELISA验证补体级联反应中Classical pathway和Lectin pathway中的关键蛋白分子C4、C4b、C3、C3b、C4BP、C5,结果显示TBI后各损伤组C4、C4b表达水平均出现显著上调(P0.05),且C4表达水平在轻、中、重度TBI组之间比较存在统计学差异(P0.05)。C3和C3b各组表达无明显差异。C4BP作为该级联通路的抑制性因子,三组不同损伤程度TBI组较正常对照组均出现显著下调(P0.05)。同样,C5表达水平在不同程度TBI组中均表达上调,且重度TBI组表达高于轻度TBI组(P0.05)。(5)采用ROC曲线分析评估C4,C4b和C5诊断TBI的准确性。ROC曲线下面积AUC值分别为:C4(0.882,P0.001),C4b(0.910,P0.001),C5(0.924,P0.001)。(6)ROC分析C4,C4b和C5诊断轻度TBI的准确性,AUC值如下:C4(0.779,P0.001),C4b(0.893,P0.001),C5(0.874,P0.001),C4b和C5在鉴定轻度TBI患者诊断准确率较高。结论:1.TBI患者血浆中miR-6867-5p,miR-3665,miR-328-5p,miR-762,miR-3195,miR-4669 and miR-2861可以作为TBI的诊断标志物。miR-3195和miR-328-5p两种miRNAs可用于鉴别诊断轻、中度TBI和重度TBI。2.miRNA靶基因GO富集分析结果显示,轻度及中度TBI患者组出现10个共同的生物过程,而只有血管加压素对全身动脉血压的调节这一生物过程在轻、中、重度TBI组均出现。3.miRNA Pathway富集分析结果显示,几条重要的通路均参与轻、中、重TBI的损伤进程,包括:p5_73信号通路、mTOR信号通路等。4.差异蛋白的GO富集分析结果显示,TBI损伤后差异蛋白更多与急性期反应,急性炎症反应,损伤反应,应激反应,血小板活化,损伤修复,凝血等生物进程相关。5.差异蛋白的pathway富集分析结果显示,三组TBI均涉及到的信号通路有Hippo信号转导途径,补体与凝血级联反应和沙门氏菌感染。6.通过差异miRNA和蛋白富集分析结果显示,轻度TBI与中度TBI的病理过程更为接近,重度TBI则相对独立。7.补体与凝血级联反应通路在TBI中活化,重度TBI组的关键蛋白C4,C4b和C5表达明显高于轻度和中度TBI组,提示其在重度TBI时活化程度更高。C4,C4b和C5可作为TBI的潜在诊断标志物,其中C4b和C5在鉴别轻度TBI时诊断准确率较高。
【图文】：

散点图,散点图

图 1-1 散点图(轻度 TBI 组 VS 正常对照组)Fig. 1-1 ScatterPlot(mild TBI group VS control group)

散点图,中度,散点图

图 1-2 散点图(中度 TBI 组 VS 正常对照组)Fig. 1-2 ScatterPlot(moderate TBI group VS control group)
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.15

【参考文献】