竹节香附素A治疗破骨细胞相关骨溶解疾病的机制研究
发布时间：2020-05-28 21:53
【摘要】：研究背景随着中国进入老龄化社会,我们骨科面临了许多有明显增长趋势的问题,如骨质疏松、关节置换后金属颗粒物对骨组织的溶解作用、肿瘤骨转移等。有近期研究表明,中国目前高达2.1亿人其骨量低于正常标准,更有甚者,我国50岁以上人群中骨质疏松的发生率高达15.7%。骨质疏松患者体内骨质量下降、骨组织微小结构退化进而脆性增加并波及全身,罹患的病症为胸腰背及全身关节酸痛、疼痛甚至骨折,其生活质量、生存时间被极大地降低,并带来了巨大的经济和社会负担。年龄相关的另一个常见问题是骨关节炎,近20年来,人工关节置换数量呈爆发式增长。人工关节置换数量的增长背后,假体周围骨溶解的问题也不断显现,该问题被称为“颗粒病”。颗粒病是由关节假体金属磨损所产生的碎屑刺激骨组织,经一系列病理生理变化后造成骨组织降解,进而导致假体松动及相应的症状。肿瘤骨转移是原发于骨组织外的恶性肿瘤其细胞经血行传播至骨组织并引起以骨病变及疼痛为主要表现的疾病。随着肿瘤病人的增加、病程的延长,骨转移也相应地增加,而脊柱由于其特性肿瘤转移的发生率最高。除了肢体疼痛,肿瘤转移到脊柱造成骨损害甚至病理性骨折还可能造成脊髓受压而致病人瘫痪。骨转移的原发恶性肿瘤最常见的是乳腺癌,一项研究表明,70%的死于乳腺癌或者前列腺癌的病人发生了骨转移。这些问题的一个共同点,就是破骨细胞的激活。破骨细胞是人体内唯一吸收骨质的细胞,它和成骨细胞维持着骨吸收骨形成平衡以保证骨组织健康。当它们被激活、其数量增加或者功能增强时,即可引起包括骨质疏松症、假体周围骨溶解、肿瘤骨转移、骨关节炎等在内的众多问题。因此,进行破骨细胞相关疾病的研究具有极高的医学和社会经济价值。虽然目前临床上使用的药物有许多,如降钙素、二磷酸盐、雌激素等在治疗这些疾病表现出一定的疗效,但仍存在骨折、骨坏死和肿瘤等多种并发症的报道。因此,我们还需要新的效果更好副作用更少的药物,而这在近年来也成为研究领域的焦点。目前,采用天然植物药提取物开展抑制破骨细胞分化和功能发挥、防治破骨细胞介导的骨溶解相关疾病的研究越来越受关注。我们通过药物筛选试验,一种以往少量用在肿瘤治疗研究的中草药单体竹节香附素A表现出了有效抑制破骨细胞的功能。因此,本研究将进一步探究竹节香附素A抑制破骨细胞的分子生物学机制及乳腺癌骨转移的细胞和分子机制,并通过动物实验确认竹节香附素A在体内预防和治疗破骨细胞相关的三类包括乳腺癌骨转移的主要疾病中的作用,为临床转化应用提供理论基础。目的研究竹节香附素A影响破骨细胞活性的分子生物学机制;研究竹节香附素A对钛颗粒诱导的骨溶解模型和裸鼠乳腺癌骨转移模型的作用及细胞和分子机制。方法采用6周大C5 7BL/6雌鼠的骨髓腔细胞作为细胞源来培养破骨细胞和成骨细胞。破骨细胞鉴定为TRAP染色、3个核及以上阳性的细胞,成骨细胞分化和功能以ALP染色和茜素红染色来评估;竹节香附素A对细胞的毒性以CCK-8试剂盒测定,并计算半数抑制浓度IC50;qRCR测定破骨细胞、成骨细胞相关基因表达量;竹节香附素A对破骨细胞骨吸收功能的抑制通过牛骨片吸收试验来验证;western blotting研究竹节香附素A抑制破骨细胞和乳腺癌细胞的信号通路。再通过构建小鼠钛颗粒诱导的颅盖骨骨溶解模型,根据组别局部注射竹节香附素A药液或者对照液每天1次,连续14天。小鼠颅盖骨标本,行microCT扫描分析和组织切片检查,以研究竹节香附素A在体内对钛颗粒诱导的破骨细胞骨溶解的抑制;为了进一步验证竹节香附素A在体内对肿瘤骨转移的作用,我们在裸鼠胫骨平台内注射乳腺癌细胞构建乳腺癌骨转移模型。再根据组别腹腔注射竹节香附素A药液或者对照液每天1次,连续28天。最后取裸鼠胫骨标本进行对照研究。结果毒性试验证实在48小时内低于0.781μM浓度、72小时内低于0.391μM、96小时内低于0.098μM的竹节香附素A条件下,BMMs细胞活性没有收到明显抑制。IC50在48小时时为3.73μM、在72小时为2.91μM、在96小时为1.94μM。竹节香附素A对其活性的抑制为浓度梯度依赖。我们将BMMs在MSC和RANKL刺激下培养,并加入不同浓度的竹节香附素A(0.2μM、0.4μM、0.8μM)、或者加入0.4μM竹节香附素A分别培养3、5、7天,结果与对照组相比,药物组破骨细胞数和面积均有不同程度下降;同时,竹节香附素A对破骨细胞分化的抑制表现出浓度时间依赖的特点。RANKL刺激后,空白组破骨细胞相关基因出现了明显的表达上调,而在竹节香附素A组,这些基因的表达有不同程度的下调;同时,竹节香附素A对这些基因的表达表现出浓量和时间依赖性的抑制作用。我们在成骨细胞培养体系内加入不同浓度的竹节香附素A,结果在第7天行ALP染色显示与空白对照组相比,成骨细胞在0.2μ、0.4μM和0.8μM竹节香附素A均无明显抑制;在第21天行茜素红染色显示0.2μM组成骨细胞性矿化较空白对照组增多,其余浓度组无明显差异。成骨细胞特异性基因表达检测显示在第7天空白组和各浓度药物组无明显差异,而在第14天药物组(0.4μM)sparc的表达明显增高。这些结果表明竹节香附素A在体外对成骨细胞分化和功能至少无明显抑制作用。我们在牛骨片上(无菌)培养BMMs,同时加入不同浓度的竹节香附素A,结果空白组牛骨片上骨吸收面积约为43%,而在0.2μM组,骨吸收的区域降低到了约18%,在0.4μM组更减少为约7%,在0.8μM组骨吸收不明显。由此我们可以明确竹节香附素A在体外具有抑制破骨细胞分化和骨吸收功能的作用。在MAPK、NF-κB和SRC/AKT等信号通路上,AKT在RANKL刺激后10min出现磷酸化,而在竹节香附素A药物组中,AKT的磷酸化在10min和30min时受到明显抑制;SRC的表达在RANKL刺激后3天明显上调,而竹节香附素A抑制了这种趋势;JNK、p38、ERK和IκBα的表达空白对照组与药物组无明显差异。进一步地,我们发现对照组SRC在破骨细胞被RANKL刺激3天后明显升高,加入竹节香附素A药物组SRC被明显抑制,而同时加入SC79实验组SRC的抑制趋势被挽救。这些结果表明竹节香附素A可能通过抑制SRC/AKT信号通路来抑制破骨细胞的分化与功能。我们在构建的钛颗粒诱导的小鼠骨溶解模型上注入生理盐水(骨溶解对照组)、不同浓度竹节香附素A药液、同时我们还设立了空白对照(不注射钛颗粒、注射生理盐水),14天后microCT显示与空白对照组相比,对照组小鼠颅盖骨溶解非常明显,而低浓度和高浓度竹节香附素A药物组骨溶解有不同程度的缓解。我们还进一步在micro-CT三维重建图像上测量了骨量与组织量比(BV/TV)和反应区域(ROI)孔隙率,结果与对照组相比,低浓度和高浓度RA组的BV/TV均有不同程度的升高,而孔隙率有不同程度的降低。同时TRAP染色显示骨溶解对照组小鼠颅骨溶解区骨表面有大量多核破骨细胞聚集,而低浓度和高浓度药物组的破骨细胞却有不同程度的减少。CTSK免疫组化染色也显示了相同的趋势。这些数据提示了竹节香附素A在体内能够抑制破骨细胞分化和骨吸收功能,抑制钛颗粒诱导的骨溶解。MDA-MB-231乳腺癌细胞系的48小时和96小时细胞毒性实验表明,大于6.25μM的竹节香附素A能明显抑制MDA-MB-231细胞系生长,IC50分别为18.01μM和15.77μM,相对于破骨细胞,MDA-MB-231细胞系对竹节香附素A的耐受性更强。EdU(5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷)检测分析表明,经不同浓度的竹节香附素A处理后24小时,MDA-MB-231细胞系的增殖被明显抑制。细胞流式分析显示竹节香附素A能显著增加凋亡细胞比例。细胞体外侵袭实验显示竹节香附素A对MDA-MB-231细胞系侵袭行为的抑制呈浓度依赖性。我们采用另一种乳腺癌细胞系BCAP37进行研究,也得到了类似结果。我们将MDA-MB-231乳腺癌细胞注射入裸鼠胫骨平台,再每天经腹腔注射PBS或竹节香附素A(100μg/kg),28天后行micro-CT和组织学检查发现。结果与竹节香附素A药物组相比,PBS对照组骨小梁骨丢失明显增加;竹节香附素A药物组BV/TV较对照组高而骨小梁间隙较对照组窄;竹节香附素A药物组骨皮质尚完整而对照组骨小梁吸收严重且骨皮质分离。进一步的TUNEL分析显示与对照组相比,药物组乳腺癌细胞的凋亡程度明显增加。这些结果提示竹节香附素A在体内能抑制乳腺癌细胞诱导的骨溶解。最后,将MDA-MB-231细胞在浓度为3μM的竹节香附素A经不同时间的处理后,我们发现AKT的磷酸化和mTOR的表达均不同程度地被下调,提示竹节香附素A对MDA-MB-231细胞生长和侵袭的抑制可能通过AKT/mTOR信号通路发挥作用。结论竹节香附素A在体外可以抑制破骨细胞分化和骨吸收而不抑制成骨细胞的分化和功能、可以抑制MDA-MB-231和BCAP37乳腺癌细胞系的生长和侵袭,在体内可以抑制钛颗粒和MDA-MB-231乳腺癌细胞系引起的骨溶解,由此我们推测竹节香附素A具有治疗破骨细胞相关疾病和乳腺癌骨转移的潜在价值。
【图文】：
第一部分竹节香附素Ａ对破骨细胞的抑制及对钛颗粒诱导的骨溶解的抑制逡逑ＢＭＭｓ细胞在含ＲＡＮＫＬ和Ｍ－ＣＳＦ的培养基中刺激培养，并加入不同浓度的竹节逡逑香附素Ａ邋（０，０．４ｍＭ，０．８ｊｉＭ）培养７天，如图１邋（Ｆ）所示，在对照组k慰姿劳銎棋义瞎窍赴保担埃，
本文编号：2685893
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第一部分竹节香附素Ａ对破骨细胞的抑制及对钛颗粒诱导的骨溶解的抑制逡逑ＢＭＭｓ细胞在含ＲＡＮＫＬ和Ｍ－ＣＳＦ的培养基中刺激培养，并加入不同浓度的竹节逡逑香附素Ａ邋（０，０．４ｍＭ，０．８ｊｉＭ）培养７天，如图１邋（Ｆ）所示，在对照组k慰姿劳銎棋义瞎窍赴保担埃，
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