miR-19对破骨细胞分化的调控和其机制的研究

发布时间：2020-06-03 12:13

【摘要】：目的:1.研究mi R-19对破骨细胞分化过程的影响;2.探明mi R-19在影响破骨细胞分化中发挥调控作用的信号通路;3.寻找mi R-19作用靶点以明确其在破骨分化过程中调控相应通路的具体机制。方法:1.通过在RAW264.7细胞系和BMM细胞中过表达和抑制mi R-19并诱导破骨分化,从TRAP染色结果和相关破骨分化指标蛋白和m RNA量中了解其对破骨分化的影响,并且检测破骨分化中mi R-19的表达量了解破骨分化对其表达的影响,通过骨板实验检测mi R-19对破骨细胞功能的影响;2.通过Western blot和EMSA实验检测mi R-19过表达中RANKL介导的各蛋白和转录因子的改变,并且在分别使用AKT和NF-κB通路抑制剂干预以上过程并观察各蛋白和转录因子的改变,从而了解各条信号通路在mi R-19影响下于破骨分化过程中发挥的作用;3.通过免疫共沉淀检测TRAF6泛素化的改变和对其抑制酶CYLD的检测来研究mi R-19调控各通路的机制,并通过si-CYLD作用BMM细胞对比mi R-19与细胞作用的效应和双荧光素酶报告系统验证的靶基因。结果:1.mi R-19过表达可以促进破骨细胞的分化和骨吸收功能,而抑制mi R-19的表达则会抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能,并且生理状况下mi R-19的表达受破骨细胞分化的调控;2.mi R-19过表达后给与RANKL刺激,NF-κB,MAPK和AKT通路的相关指标均较对照组升高,给与AKT通路抑制剂干预后,检测到除AKT外各通路指标没有明显改变,NF-κB通路抑制剂作用后对mi R-19过表达促进的破骨分化过程有抑制作用。3.mi R-19过表达后给与RANKL刺激,TRAF6结合的泛素化指标升高,mi R-19过表达后会抑制CYLD蛋白,同时si-CYLD作用于BMM细胞的效应与mi R-19过表达基本一致,双荧光素酶报告系统检测到mi R-19会与含有CYLD-3’UTR报告载体在细胞内特异性结合。结论:mi R-19在破骨细胞分化过程中发挥正向调控功能,其功能发挥的靶基因是CYLD,并通过抑制该蛋白的表达,从而促进TRAF6的泛素化激活并促进下游NF-κB,MAPK和AKT通路的活化发挥其正向调控能力。
【图文】：

转染,效率,细胞系

结果1. miR-19 mimic 及 inhibitor 转染 RAW264.7 细胞系为了检测购买的商品 miR-19 mimic 和 inhibitor 的可靠件，分别在 RAW264.7 细胞系和小鼠 BMM 细胞中转染 miRmiR-19a mimic 及 miR-19b mimic ，48 小时后提取总 RNA，通过技术检测细胞内转染后的 miR-19 表达量，，因 miR-19a 与 miRmiR-19 引物检测时对两种 RNA 无差别性，故所检测 miRNA 如图（1-1-A）所示，转染 mimic 后 miR-19 表达量均明显升高，后表达量较对照组有不同程度下调。

BMM 细胞的破骨诱导分化为了检验细胞内 miR-19 表达升高对破骨细胞分化的影响，我们先选RAW264.7 细胞系来进行研究。RAW264.7 细胞种板后分别转染 miRNA mimic N和 miR-19a mimic 及 miR-19b mimic 后加入含 50ng/mLRANKL 和 30ng/mLM-破骨诱导培养基进行诱导，4 天或 5 天后固定并行 TRAP 染色，镜下观察(1-2-A,B,C)所示，与对照 NC 组相比，miR-19a 组和 miR-19b 形成 TRAP 阳性细≥3）在第 4 天和第 5 天时均是较多的，且形态较大。为了更加真实的模拟 miR巨噬细胞向破骨分化的过程的影响，我们选用原代 BMM 细胞来进行诱导试验。细胞从小鼠体内分离后种板，分别转染 miRNA mimic Ncontrol 和 miR-19a mmiR-19b mimic 后诱导破骨，7 天后 TRAP 染色观察结果。镜下如图(1-2-D,E)所对照 NC 组相比，miR-19a 组和 miR-19b 形成 TRAP 染色阳性细胞较多，且形态结果与 RAW264.7 细胞系所得致。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68

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